慢性心力衰竭患者血清微小RNA-24、转化生长因子-β1表达水平及其与心肌重构和心功能的关系△

李志芳，方红城，董丽妍，周 俊，段成城

（深圳市中西医结合医院心血管病科，广东深圳 518104）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是临床常见的重症疾病，老年人群的CHF 发病率逐年增加，其致死率及致残率均明显增高，严重影响患者生命安全［1］。研究表明CHF 的发病机制主要为神经内分泌过度激活与心脏重构［2］。因而探究影响CHF 患者心功能的相关因子对临床诊断及早期治疗均具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是具有高度保守性的小RNA 分子，其可参与体内多种生物学过程，研究表明部分miRNA 可参与多种心血管疾病发生及发展过程［3］。相关研究表明微小RNA-24（microRNA-24，miR-24）在血管内皮细胞损伤时表达水平有异常变化，并与冠状动脉病变发生及发展密切相关［4］。近来研究表明，原发性梗死后心脏纤维化过程中miR-24 表达水平明显降低，而转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）mRNA 表达水平显著升高，miR-24 可能通过抑制TGF-β1 表达进而参与原发性梗死后心脏纤维化过程［5］。关于miR-24、TGF-β1 与CHF 发生的相关研究相对较少，因此本研究主要分析miR-24、TGF-β1 在CHF 患者血清中表达变化及关系，探讨其与CHF 患者心肌重构及心功能的关系，为临床早期诊断及干预CHF提供参考指标。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2017年2月至2018年9月于深圳市中西医结合总医院治疗的CHF 患者108 例作为研究对象，其中男61 例，女47 例，年龄为（61.02±8.65）岁，所有患者均符合CHF 诊断标准［6］，CHF患者原发病类型分别为高血压性心脏病（42 例）、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）（45 例）、风湿性心脏病（15 例）、扩张型心肌病（6 例）。根据美国纽约心脏协会（New York Heart Association，NYHA）心功能分级标准将CHF 组患者划分为Ⅰ～Ⅱ级组36 例、Ⅲ级组35 例、Ⅳ级组37 例［7］。另选取同期本院体检中心健康者56 名为对照组，其中男31 名，女25 名，年龄为（60.14±7.34）岁。本研究经本院伦理委员会批准，所有受试者均知情同意。两组受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：（1）CHF患病时间超过6个月；（2）心力衰竭症状持续时间超过6 个月；（3）左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜45%。排除标准：（1）合并恶性肿瘤患者；（2）合并心脏瓣膜病患者；（3）近期接受经皮冠状动脉介入治疗患者；（4）肝及肾等重要脏器功能严重损伤患者；（5）不稳定型心绞痛或急性心肌梗死患者。

1.2 超声心动图检查方法

应用Philips iE33 超声检测仪（上海涵飞医疗器械有限公司）检查所有受试者二维、三维超声心动图，检测其心肌重构及心功能指标。心肌重构指标：左心室舒张末期内径（left ventricular enddiastolic diameter，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心房内径（left atrial diameter，LAD）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall depth，LVPWD）、左心室质量指数（left ventricular mass index，LV⁃MI）、左心室重构指数（left ventricular remodeling index，LVRI）。心功能指标：心排血量（cardiac output，CO）、左心室射血分数（left ventricular ejec⁃tion fraction，LVEF）。

1.3 血液样本采集

所有受试者均于入组后次日清晨抽取空腹静脉血10 mL，2 000 r/min 离心15 min，留取血清，用于检测血清miR-24、TGF-β1 mRNA 表达水平，将血液样本保存于-80℃超低温冰箱以备检。

1.4 实时定量聚合酶链反应检测血清miR-24、TGF-β1 mRNA 表达水平

总RNA 提取：取出冻存血清，参照TRIzol 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）说明操作。反转录：参照反转录试剂盒（赛默飞世尔科技公司）将RNA 反转录为cDNA。miR-24、TGF-β1 及内参引物均由上海生工股份有限公司设计合成，miR-24 F：5′-GCGGCGGTGGCTCAGTACAGC-3′，R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6：F5′-GCTCGCTTC⁃GGCAGCACA-3′，R：5′-GAGGTATTCGCACCAGA⁃GGA-3′；TGF-β1 F：5′-TGGACCGCAACAACGC⁃CATCTA-3′，R：5′-CAGCTCTGCACGGGACAGCA⁃AT-3′；β-actin F：5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，R：5′-TGATGTCACGCACGATTT-3′。实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）反应体系共20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡPCR Mix 10 μL，cDNA 1.0 μL，上下游引物各1.6 μL，ddH2O 7.4 μL。反应条件：95 ℃2 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共40个循环，72 ℃终延伸7 min。反应结束后对各孔循环数（Ct 值）进行分析，miR-24 以U6 为内参基因，TGF-β1 以β-actin 为内参基因，采用2-ΔΔCt相对定量法计算miR-24、TGF-B1 mRNA 的相对表达量。

1.5 统计学分析

采用统计学软件SPSS 22.0 对数据进行分析。计量资料先进行正态分布检验，若符合正态分布，采用（）进行统计描述，然后进行方差齐性检验，若方差齐，多组数据比较采用单因素方差分析，方差分析有统计学差异则再采用LSD-t或SNK-q进行两两比较。对于方差不齐或非正态分布的资料，可进行数据变换或采用Wilcoxon 秩和检验。Pearson 法对各参数进行相关性分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组受试者血清miR-24、TGF-β1 mRNA 表达水平比较

CHF 组不同心功能等级患者血清miR-24 表达水平显著低于对照组（P＜0.05），Ⅲ级与Ⅳ级组显著低于Ⅰ～Ⅱ级（P＜0.05），且Ⅳ级组显著低于Ⅲ级组（P＜0.05），差异有统计学意义；CHF 组不同心功能等级患者血清TGF-β1 mRNA 表达水平显著高于对照组（P＜0.05），Ⅲ级与Ⅳ级组显著高于Ⅰ～Ⅱ级组（P＜0.05），且Ⅳ级组显著高于Ⅲ级组（P＜0.05），差异有统计学意义，详见表1。

表1 各组受试者血清miR-24、TGF-B1 mRNA 表达水平比较 ［］

表1 各组受试者血清miR-24、TGF-B1 mRNA 表达水平比较 ［］

注：与对照组比较，*P＜0.05；与Ⅰ～Ⅱ组比较，1）*P＜0.05；与Ⅲ级组比较，2）*P＜0.05

2.2 各组受试者心肌重构及心功能指标比较

CHF 组患者LVEDD 显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同心功能等级组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同心功能等级CHF患者LAD、LVPWD、LVMI 均显著高于对照组，Ⅳ级与Ⅲ级组显著高于Ⅰ～Ⅱ级组，且Ⅳ级显著高于Ⅲ级，差异有统计学意义（P＜0.05）；而LVRI、CO、LVEF 均显著低于对照组，Ⅳ级与Ⅲ级组显著低于Ⅰ～Ⅱ级组（P＜0.05），且Ⅳ级组显著低于Ⅲ级组，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2。

表2 各组受试者心肌重构及心功能指标比较 ［］

表2 各组受试者心肌重构及心功能指标比较 ［］

注：与对照组比较，*P＜0.05；与Ⅰ～Ⅱ组比较，1)*P＜0.05；与Ⅲ级组比较，2)*P＜0.05

2.3 血清miR-24、TGF-β1 表达水平与CHF 患者心肌重构及心功能指标的关系

CHF 患者血清miR-24 表达水平与LVEDD、LVPWD、LVMI均呈显著负相关（P＜0.05），而与LVRI、CO、LVEF 呈显著正相关（P＜0.05）；CHF 患者血清TGF-β1 表达水平与LVEDD、LVPWD、LVMI 均呈显著正相关（P＜0.05），而与CO、LVEF 呈显著负相关（P＜0.05），详见表3。

表3 血清miR-24、TGF-β1 表达水平与CHF 患者心肌重构及心功能指标的关系

3 讨论

CHF 是各类心脏疾病的终末期表现，其以心脏收缩或舒张功能障碍为主要特征，本质是出现心肌重构并引发一系列病理学改变。研究表明，神经内分泌长时间兴奋及过度激活导致心肌组织重构［8-9］。有研究指出，miRNA 与多种心血管疾病发生及发展密切相关［10］。因此，探讨miR-24 与CHF 患者心肌重构及心功能的关系可为进一步揭示其发生机制提供新思路。

miR-24 可调控一氧化氮合酶（eNOS）表达进而调节血管内皮细胞增殖，研究显示miR-24 可参与冠状动脉病变发生过程［11-12］。有研究表明，miR-24 在急性心肌梗死患者血清中呈低表达，其可抑制神经细胞凋亡，其表达水平越低的患者疾病的进展越快［13］。相关研究表明，上调miR-24 表达水平可减轻心肌梗死大鼠心肌损伤［14］。本研究结果显示，CHF 组不同心功能等级患者血清miR-24 表达水平明显低于对照组，且随着心功能等级升高而显著降低，说明CHF 患者血清中miR-24 呈低表达参与CHF 发生过程，随着疾病进展其表达水平明显降低。

TGF-β1 是由肺巨噬细胞及上皮细胞分泌，其可激活丝/苏氨酸蛋白激酶（ERK）信号通路并促进细胞外基质蛋白合成，进而参与肺组织结构重建过程，最终引发肺纤维化［15］。研究表明，早期糖尿病肾病患者血清TGF-β1 浓度明显升高，可参与糖尿病肾病发生过程［16］。相关研究指出，微小RNA-133（miR-133）可通过负向调控TGF-β1 表达进而改善心肌梗死后心肌重构［17］。关于TGF-β1在CHF 患者血清中的表达研究相对较少，本研究结果显示CHF 组不同心功能等级患者血清TGF-β1 mRNA 表达水平明显高于对照组，随着心功能等级的升高其表达水平显著升高，说明CHF 患者血清TGF-β1 表达水平升高可参与CHF 发生过程，随着疾病严重程度加重其表达水平明显升高。同时，本研究分析miR-24 与TGF-β1 的相关性，结果显示miR-24与TGF-β1呈负相关，提示miR-24与TGFβ1相互作用并共同参与CHF发生及发展过程。

通过检查CHF 患者心肌重构及心肌功能相关指标，结果显示CHF 组患者LVEDD、LAD、LVP⁃WD、LVMI 均明显高于对照组，Ⅳ级与Ⅲ级组明显高于Ⅰ～Ⅱ组级，且Ⅳ级组明显高于Ⅲ级组，而LVRI、CO、LVEF 均明显低于对照组，且随着心功能等级升高而明显降低，说明CHF 患者出现心肌重构并伴随心功能降低，随着CHF 患者疾病发展，心肌重构现象越严重且心功能越差。同时本研究分析miR-24、TGF-β1 与CHF 患者心肌重构及心功能指标的相关性，结果显示miR-24 与LVEDD、LVPWD、LVMI 均呈显著负相关，而与LVRI、CO、LVEF 呈显著正相关，TGF-β1 与LVEDD、LVPWD、LVMI 均呈显著正相关，而与CO、LVEF 呈显著负相关，说明CHF 患者血清miR-24 表达水平降低与TGF-β1 表达水平升高可促使患者心肌发生重构及左心室呈进行性扩张进而加重心功能严重程度。提示血清miR-24、TGF-β1 表达水平变化与CHF 患者心肌重构及心功能指标有关，并可作为反映CHF 患者心肌重构及心功能的重要指标。

综上所述，miR-24 在CHF 患者血清中呈低表达并随疾病加重而明显降低，而TGF-β1 表达水平明显升高且随疾病加重而明显升高，二者呈负相关且均与CHF 患者心肌重构及心功能密切相关。本研究存在不足之处，关于miR-24 与TGF-β1 是否存在靶向关系及其在CHF 患者心肌重构过程中的具体作用机制有待深入研究。