心房颤动患者ABCB1 基因多态性与达比加群酯临床疗效的关系△

2021-03-07薄雅坤骆小梅王贵鹏

岭南心血管病杂志 2021年1期

薄雅坤，骆小梅，王贵鹏

（新疆医科大学第五附属医院心血管内科，乌鲁木齐 830011）

心房颤动是最常见的持续性心律失常，常常会导致患者发生脑卒中。为减少心房颤动患者血栓栓塞和脑卒中的发生，一般口服法华林或达比加群酯等抗凝剂。达比加群酯作为新型口服抗凝剂，可有效抑制关键凝血因子，阻碍血栓形成，预防心房颤动患者脑卒中发生。然而，达比加群酯在降低脑卒中风险的同时，也会增加出血风险。P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是三磷酸腺苷结合盒转运载体蛋白（adenosine triphosphate-binding cassette transporter，ABC）中最大的一个亚系，可以影响多种药物的吸收和代谢［1-2］。而达比加群酯作为P-gp 的底物，其代谢水平很可能受到P-gp 表达和活性的影响。P-gp的编码基因是ABCB1，ABCB1多态性（尤其是C3435T）可以影响P-gp 的表达和活性［3］。本文主要研究了新疆维吾尔族（维族）心房颤动患者ABCB1 基因C3435T 多态性与达比加群酯治疗效果（包括血药浓度、治疗4 d 后凝血指标以及致出血风险）的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2015 年1 月至2016 年12 月在新疆医科大学第五附属医院住院或门诊就诊的心房颤动患者166例作为研究对象，其中汉族患者93例（男47例、女46例），维族患者73例（男37例、女36例）。纳入标准：年龄≥18 岁、CHADS2 评分（表1）≥2 分的非瓣膜性心房颤动患者。非瓣膜性心房颤动诊断标准：2014 美国心脏协会（AHA）/美国心脏病学会（ACC）/美国心律学会（HRS）心房颤动指南定义为在不合并风湿性二尖瓣病变、机械或生物瓣膜置换术以及二尖瓣成形术的情况下而出现的心房颤动。记录患者年龄、身高、性别、体质量指数、体质量、出血事件及原发性高血压（高血压）、糖尿病、心力衰竭、脑卒中或短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）史和CHADS2 评分等一般资料。遵循随机数字表法入选的患者随机分为维族心房颤动组和汉族心房颤动组。研究对象在试验前均签署知情同意书。

1.2 ABCB1 基因多态性检测方法

1.2.1 血液标本采集及基因组DNA 提取采集患者外周血5 mL 于0.01%乙二胺四乙酸抗凝试管中，-80 ℃冻存，用于DNA 提取。DNA 提取采用PAX gene Blood DNA 提取试剂盒（天根），经分光光度仪检测其浓度、纯度，用琼脂糖凝胶电泳进行DNA 质量及完整性的质检。

1.2.2 基因型检测在UCSC、HapMap 数据库中选择出ABCB1 基因的标签单核苷酸多态性（sin⁃gle nucleotide polymorphism，SNPs）（C3435T 位点），利用Primer Premier 5.0 设计跨ABCB1_C3435T 位点的引物，进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。引物序列合成由北京擎科生物科技有限公司完成。

PCR反应体系50 μL：Ex Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL，dNTPs Mix 4 μL，模板DNA 2 μL，上游引物ABCB1-cx-439F和下游引物ABCB1-cx-439F（10 pmol·μL-1）各2 μL，灭菌超纯水34.5 μL。反应循环参数：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min（表2），35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的片段切胶回收后送北京擎科生物科技有限公司测序。

根据测序获得的序列，找到其中的SNPs 位点，设计两对特异引物靶向不同的位点，进行PCR扩增。PCR 反应体系50 μL：Ex Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL，dNTPs Mix 4 μL，模板DNA 2 μL，两对特异引物（400F-T、400F-T 和250F-C、250R-C）（10 pmol·μL-1）各2 μL，灭菌超纯水30.5 μL。反应循环参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s（表2），35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 ABCB1 基因引物信息

1.3 达比加群酯血药浓度检测

于患者服药3 d 后抽取外周抗凝血1 mL，用液相色谱仪检测。用甲醇沉淀血浆蛋白，采用Kro-masil C18 柱（100 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.01 mmol·L-1甲酸铵溶液-甲醇（77∶23），流速为0.5 mL·min-1。测晨起服药后2 h 和12 h（晚间服药前）的血药浓度作为峰浓度和谷浓度。

1.4 凝血指标检测

在Sysmex CS5100 上检测维族心房颤动患者服用达比加群酯前和服用4 d 后的凝血指标，包括活化部分凝血酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、国际标准化比值（International normalized ratio，INR）并记录相关数据。

1.5 一般指标观察

所有入选患者均经知情同意后开始口服达比加群酯110 mg，一天2 次治疗，在服药前、服药后4 周、12 周分别进行凝血功能、血常规及肝、肾功能检测，并观察患者服药后1 年内发生全身栓塞及出血事件的情况。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据处理。计数资料以［n（%）］表示，采用χ2检验。计量资料以（）表示，两组间采用t检验，多组间比较采用F检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉族和维族患者基线资料比较

汉族与维族两组患者年龄、身高、性别、体质量指数、体质量、出血事件及高血压、糖尿病、心力衰竭、脑卒中或TIA 史和CHADS2 评分等一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3 和表4。

表3 汉族和维族患者计量临床资料比较［］

表4 汉族和维族患者计数临床资料比较［n（%）］

2.2 ABCB1 基因型鉴定结果

使用跨ABCB1_C3435T位点的引物对患者基因组DNA 进行PCR 扩增，将PCR 产物回收后进行测序。对患者基因组DNA 进行PCR 扩增用以检测ABCB1 基因C3435T 位点。琼脂糖凝胶电泳显示：CT 型杂合子含有一条约250 bp 的条带和一条约400 bp 的条带；CC 型纯合子含有一条约250 bp 的条带；TT 型纯合子含有一条约400 bp 的条带。测序结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果吻合（图1）。

2.3 汉族和维族患者基因型及等位基因频率分布比较

汉族患者共93 例，其中C3435T 位点CC、CT、TT 基因型分别为29 例（31.2%）、46 例（49.5%）、18例（19.3%）；C和T 等位基因分别为104例（55.9%）、82 例（44.1%）；维族患者共73 例，其中C3435T 位点CC、CT、TT 基因型分别为23 例（31.5%）、36 例（49.3%）、14 例（19.2%）；C 和T 等位基因分别为82 例（56.2%）、64 例（43.8%）。维族和汉族两组患者中的CC、CT、TT 基因型频率及等位基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

图1 ABCB1 基因型C3435T 基因型鉴定图

表5 汉族和维族患者基因型及等位基因频率分布比较

2.4 达比加群酯血药浓度与基因型的关系

将心房颤动患者按照C3435T 位点基因型分为CC 型组，TT 型组和CT 型组，分析比较不同基因型的维族心房颤动患者经相同剂量的达比加群酯治疗期间血药浓度的差异，结果表明，TT 型组患者的血药峰浓度最高，CT 型组次之，CC 型组最低，方差分析表明三者总体差异具有极显著性（P＜0.001），见表4。任意两组患者的血药峰浓度比较，差异均具有统计学意义（P＜0.001），见图2。TT 型组患者的血药谷浓度最高，CT 型组次之，CC型组最低，方差分析表明三者总体差异具有极显著性（P＜0.001），见表4。任意两组患者的血药谷浓度比较，差异有统计学意义（P＜0.001），见图2。

表6 不同基因型患者达比加群酯治疗后血药浓度比较［mg·L-1，］

2.5 达比加群酯治疗前后凝血指标的比较

维族心房颤动患者服用达比加群酯后4 d 的凝血指标APTT［（35.11±5.10）svs.（29.94±1.58）s，P＜0.01］、TT［（80.28±44.44）svs.（18.82±1.50）s，P＜0.01］、PT［（12.55±1.03）svs.（11.21±0.96）s，P＜0.01］、INR（1.39±0.17vs.1.13±0.14，P＜0.01）比服用前显著升高，差异有统计学意义，见图3。

图2 不同基因型患者达比加群酯治疗后血药浓度比较（图A 为峰浓度，图B 为谷浓度）

图3 达比加群酯治疗前后凝血指标比较（注：与治疗前比较，**P＜0.05）

2.6 不同基因型患者治疗前后凝血指标比较

不同基因型患者服用达比加群酯前APTT、TT、PT、INR 比较，差异无统计学意义（P＞0.01），服用达比加群酯后APTT、TT、PT、INR 均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。其中APTT 和APTT变化率在TT 型组中显著高于CT 型组和CC 型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；TT 和TT 变化率在TT 型组中显著高于CC 型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；而PT 和PT 变化率、INR 和INR 变化率在不同基因型患者中比较，差异无统计学意义（P＜0.05），见表7。

2.7 达比加群酯治疗后出血事件与基因型的关系

分析比较ABCB1 不同基因型的维族心房颤动患者在达比加群酯治疗期间的出血事件发生率，结果表明，CC、CT、TT 基因型的心房颤动患者在达比加群酯治疗期间的出血事件发生率比较，差异无统计学意义［8.7%（2/23）vs.5.6%（2/36）vs.14.3%（2/14），P＞0.05］。

3 讨论

已有研究报道指出，在不同地区、不同民族ABCB1 基因C3435T 的分布频率有所不同［4］。本研究通过检测ABCB1 基因C3435T 多态性，比较了新疆地区汉族和维族心房颤动患者之间的差异，结果显示，汉族和维族心房颤动患者C3435T 多态性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究结果与文献中中国人在该位点的频率分布相符［4-5］。

表7 不同基因型患者治疗前后凝血指标比较

ABCB1 基因C3435T 已被报道能够影响多种药物的血药浓度，如华法林、钙调磷酸酶抑制剂、他克莫司和利培酮等［7-10］。本研究比较了ABCB1基因C3435T 不同基因型维族心房颤动患者达比加群酯治疗后血药浓度，结果显示，3 种基因型患者的血药峰浓度和血药谷浓度均有显著差异，TT型最高，CC 型最低。ABCB1 基因编码P-gp，C3435T多态性虽然不改变P-gp 的氨基酸序列，但是能够改变P-gp 的表达和活性［11-12］。本研究中ABCB1基因C3435T 很可能是通过影响P-gp 的表达和（或）活性影响了达比加群酯的代谢，进而影响了患者体内达比加群酯的血药浓度。

本研究比较了ABCB1 基因C3435T 不同基因型维族心房颤动患者达比加群酯治疗后凝血指标，结果显示，3 种基因型患者的APTT 存在显著差异；CC 型患者和TT 型患者的TT 存在显著差异；3 种基因型患者的PT、INR 差异不明显。有研究报道，达比加群酯血药浓度与APTT 和TT 存在线性正相关，而与PT 不相关［13］。表明TT 型患者的APTT 和TT 显著高于CC 型患者可能是因为TT 型患者达比加群酯血药浓度显著高于CC 型患者。

出血事件是抗凝治疗的不良反应之一。本研究比较了ABCB1 基因C3435T 不同基因型维族心房颤动患者达比加群酯治疗后出血事件，结果显示，3 种基因型患者中出血事件发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明ABCB1 基因C3435T对维族心房颤动患者达比加群酯治疗后是否发生出血事件没有影响。