中药治疗不孕症方剂核心药组挖掘及其分子作用机制研究❋

孙占东，刘 嘉，曾庆琪

(江苏卫生健康职业学院，南京 211800)

不孕症作为一种妇科常见的疑难病种，是目前临床医学关注的热点，世界卫生组织(WHO)已将其列为影响人类生活和健康的三大主要疾病之一[1]。中医自古就对不孕症有着深入的研究与认识，在治疗不孕症方面可谓内容丰富、效果显著[2]。多部经典中医古籍，如《黄帝内经》《诸病源候论》《千金要方》等就有提及“无子”“全不产”“断绪”病证，且中医研究依据不孕症的病因、病机、证候逐步形成了辨证论治思想[3-4]。中药方剂作为一种中医临床治疗疾病的基本方式，是由多种药物组合、作用形成的一个复杂的“方剂-机体”药效体系，具有多靶点、多环节、多层次的药理学作用特点[5]。大量的中药方剂已被古今中医应用于临床实践，但目前尚缺乏从系统整体角度对不孕症方剂的组方用药规律、核心药物、药物化学成分、靶标及作用机制的发现、辨识和分析研究。本研究从“疾病-方剂中药-化学成分-靶点-基因功能”角度, 以数据挖掘、网络构建、富集分析等为手段，探究中药治疗不孕症方剂的核心药物、药效物质基础及其可能的分子作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方剂来源于《中医方剂大辞典》[6]、方剂现代应用数据库(国家人口与健康科学数据共享服务平台)、《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》(简称《中药成方制剂》)，分别以“不孕”“无子”“断续”“全不产”等关键词对上述数据库及典籍进行检索，获得初始方剂检索数据。对初始数据进行筛选，在方剂主治功效中，应明确提及至少1个检索关键词。对存在以下情况的方剂进行排除：单味中药或组成不完整；外用方剂；同一方剂在不同数据库中重复，仅取其一；方剂中药组成相同、名称不同，仅取其一。其余方剂全部作为标准数据进行纳入，构建不孕症方剂数据集。

1.2 方法

1.2.1 中药治疗不孕症方剂核心药组挖掘 利用由中国中医科学院中药研究所研发的“中医传承辅助系统”(V2.5)[7]进行中药治疗不孕症方剂的核心药组挖掘。将获得的不孕症方剂数据集录入中医传承辅助系统 (V2.5)。同时，以2015年版《中国药典》[8]为标准，对不同炮制方式、不同地域、异名同药的中药，进行统一规范化预处理，统一为标准同一中药名称收录。如“元芪”“黄耆”等统一为“黄芪”，“薯蓣”“炒山药”等统一为“山药”。数据的录入由双人完成，以确保数据的准确性。利用软件中的“统计报表” “数据分析”模块功能对录入的方剂数据进行用药规律分析，内容包括药物频次统计、药组模式等。对于核心药组的提取，是将用药频次大于20%(单味药物在方剂中出现的次数超过总方剂数的20%)与药组频次大于20%(药组在方剂中出现的次数超过总方剂数的20%)所共有的中药作为中药治疗不孕症方剂核心药组。单味用药频次的获取过程，应用“统计报表”中的药物频次统计，可一键化获得各味中药的用药频次，选取次数大于总方剂数×20%的药物；对于药组频次的统计，是应用数据分析系统中的组方分析功能，基于关联规则算法，将设置“支持度个数”(总方剂数×20%)获得计算结果。

1.2.2 中药治疗不孕症方剂核心药组化学成分与靶点蛋白数据的收集 TCMSP(http:∥lsp.nwu.edu.cn/index.php)[9]是中草药系统药理学平台，包含中国药典注册的499种中药，可获取中药的化合物、靶点和药物靶点网络等信息。将获得的核心药组数据分别输入到该平台中，获取每味药的化合物、靶点蛋白数据。将某味中药名称输入平台后，首先应用平台中的药物ADME性质进行药物有效成药化合物的筛选，根据TCMSP中ADME性质建议筛选标准，将药物口服生物利用率(OB)标准设置为≥30%、类药性(DL)标准为≥0.18，获得该味中药的有效成药化合物；其次，利用平台Related Targets板块中的筛选功能，获取该味中药所有有效成药化合物的靶点蛋白数据；最后，对于每味药物的化合物-靶点对应信息，选取来源于DrugBank中记录的数据。

1.2.3 利用UniProt查询靶点蛋白编码基因 对从TCMSP中获取每味中药的靶点蛋白，在UniProt数据库中获得相应的编码基因。UniProt(https:∥www.uniprot.org/)[10]是目前信息最丰富、资源最广的免费蛋白质数据库。在网站检索框输入“organism:‘Homo sapiens ’(Human) [9606]”，可下载获得人类蛋白名称信息、蛋白编码基因名称数据集，如Protein names(Alcohol dehydrogenase 1B)，Gene name(ADH1B)。利用数据集，分别获得每味中药的靶点蛋白编码基因集。

1.2.4 构建核心药组药物作用靶点共有编码基因集的蛋白互作网络 获取核心药组每味药物的靶点蛋白编码基因集后，对各个药物所共同作用的基因进行提取。利用Cytoscape 3.4软件绘制不孕症核心药组药物与共同作用靶点基因网络图。利用BioGRID(https:∥thebiogrid.org/)[11]构建核心药组共有基因集的蛋白互作网络。BioGRID数据库是一个经典的蛋白质相互作用数据库，截止2019年1月，共包含人类23291个基因间的361468个相互作用关系。

1.2.5 基因富集分析 基因的富集分析可揭示生物分子作用机制。利用DAVID(https:∥david.ncifcrf.gov/)[12]数据库，进行Gene Ontology、KEGG生物通路、Tissue expression分析，对于所得结果当P<0.05时，富集结果有统计学意义。将核心药组靶点蛋白编码基因集输入DAVID数据库进行Gene Ontology分析与KEGG生物通路，通过该项分析可以找出在统计上显著富集的GO条目、生物通路，寻找可能的基因功能以及获取代谢、遗传信息、细胞过程、药物分子间的相互作用等信息。将核心药组药物共有基因集的蛋白互作网络所包含的全部基因，输入DAVID数据库进行Tissue_Expression组织表达分析(选取 UP_TISSUE模块)，该分析可对基因进行组织表达位置的鉴定。

2 结果

2.1 中药治疗不孕症方剂单味药用药频率统计

严格依据方剂筛选与数据录入条件，分别收录《中医方剂大辞典》方剂265首，方剂现代应用数据库13首，《中药成方制剂》18首，共计296首中药治疗不孕症方剂，包含335味中药。对各味中药在方剂中出现的频率进行统计，提取频率大于20%的药材从高至低进行列出，分别为当归(60.81%)、川芎(47.30%)、熟地黄(40.20%)、白芍(40.20%)、茯苓(39.19%)、人参(37.16%)、甘草(29.73%)、香附(29.39%)、白术(27.03%)、牛膝(23.99%)、肉桂(23.65%)、生地黄(22.97%)、生姜(20.27%)。

2.2 中药治疗不孕症方剂药物组合模式统计

表1示，应用中医传承辅助平台数据分析系统中的组方分析功能，基于软件的关联规则算法，将“支持度个数”设置为60，即提取在全部方剂中出现占比至少为20%的药物组合。

表1 治疗不孕症方剂的药物组合模式(支持度≥60)

2.3 中药治疗不孕症方剂核心药物确定及相似方剂分析结果

在中药治疗不孕症方剂中，单味药用药频率大于20%的药物共计13味，药组用药频率大于20%的药物共计9味，结合单味用药频次与药组频次，得出中药治疗不孕症方剂核心药物组成为当归、香附、川芎、熟地黄、白芍、茯苓、甘草、人参、白术。利用中医传承辅助平台中的组方分析功能，将这9味核心药物作为组合与全部收录的296首方剂进行相似分析，发现与《医略六书》卷二十七中记录的胜金丸最为相似。胜金丸包含该核心药组全部药物，其组方为“熟地黄5两，人参1两半，白术1两，茯苓1两半，当归3两，白芍1两半，川芎1两，桂心1两半，香附2两，白薇1两，延胡索1两半，甘草5钱”。

2.4 中药治疗不孕症方剂核心药物有效成药化合物、作用靶标及其基因分析

2.4.1 药物化学成分统计分析 通过TCMSP软件分析可知，核心药组9味中药共计包含162个有效成药化学物，其中当归共计获得2个有效成分，包括β-谷甾醇和豆甾醇；香附共计获得15个有效成分，包括金圣草(黄)素、豆甾醇苷、醋酸糖酯、山奈酚等成分；川芎共计获得7个有效成分，包括亚油酸乙酯、川芎醌、谷甾醇等成分；熟地黄共计获得2个有效成分，包括谷甾醇、豆甾醇；白芍共计获得13个有效成分，包括芍药苷、苯甲酰芍药苷、儿茶素等成分；茯苓共计获得15个有效成分，包括茯苓酸、常春藤皂苷元、去氢齿孔酸等成分；甘草共计获得92个有效成分，包括甘草黄酮醇、甘草苷、异黄酮醇、甘油三酯等成分；人参共计获得22个有效成分，包括人参皂苷、五味子酯乙、β-谷甾醇、花生四烯酸等成分；白术共计获得7个有效成分，包括A-香树素、β-榄香醇、棕榈酸等成分。

2.4.2 药物作用靶蛋白分析 表2示，中药的化学成分多样，成分与靶标之间呈现多对多的复杂作用关系。以TCMSP分析结果为基础，选择Drugbank数据库来源的“成分-靶标”信息数据。当归2个有效成药化合物与47个靶蛋白存在63个作用对；香附15个有效成药化合物与97个靶蛋白存在226个作用对；川芎7个有效成药化合物与30个靶蛋白存在42个作用对；熟地黄2个有效成药化合物与31个靶蛋白存在34个作用对；白芍13个有效成药化合物与68个靶蛋白存在95个作用对；茯苓15个有效成药化合物与25个靶蛋白存在30个作用对；甘草92个有效成药化合物与140个靶蛋白存在1643个作用对；人参22个有效成药化合物与91个靶蛋白存在224个作用对；白术7个有效成药化合物与19个靶蛋白存在23个作用对。

2.4.3 药物作用靶标基因分析 表3示，利用Uniprot数据库中记录的人类蛋白、编码基因数据集获取每味中药靶标的编码基因。其中当归作用靶标基因46个，香附作用靶标基因91个，川芎作用靶标基因28个，熟地黄作用靶标基因31个，白芍作用靶标基因66个，茯苓作用靶标基因24个，甘草作用靶标基因136个，人参作用靶标基因88个，白术作用靶标基因18个。核心药组9味中药包含靶标基因157个，将超过60%(即6味)中药都具有的靶标基因纳入“关键靶基因集”，该基因集包括基因28个(图1)。

表2 中药治疗不孕症方剂核心药物间共有作用靶标分析比较

表3 超过60%核心药组药物都含有的靶标基因

图1 核心药组9味中药关键靶基因网络图

2.5 中药治疗不孕症方剂核心药物化合物靶标编码基因GO与生物通路分析

对核心药组9味中药所含化合物作用靶标编码的全部498个基因进行gene ontology与生物通路分析。GO分析包括分子功能(molecular function)、生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)三部分。其中显著富集出的分子功能为45个条目，包括蛋白结合(protein binding)、蛋白质同源/异二聚化活化(protein homodimerization/heterodimerization activity)、转录因子结合(transcription factor binding)等；生物过程有132个条目，包括信号传导(signal transduction)、RNA聚合酶II启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、药物反应(response to drug)、细胞增殖的正调控(positive regulation of cell proliferation)、转录的正调控过程(positive regulation of transcription)等；细胞组分有32个条目，包括细胞质(cytosol)、线粒体(mitochondrion)、细胞外空间(extracellular region)、细胞核浆(nucleoplasm)等。核心药物靶标编码基因GO富集条目占比(富集基因/条目全部基因)从高至低以各类前10条目排序(图2)。

图2 核心药物靶标编码基因GO富集条目占比前10条目(从高至低排序)

图3 核心药物靶标编码基因生物通路显著富集条目(P-value值排序)

图4 关键靶基因集蛋白互作网络组织表达分析显著富集前10位置(P-value值排序)

通过生物通路富集分析，得到显著富集的生物通路93条。核心药物靶标基因显著富集在神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、催乳素信号途径(Prolactin signaling pathway)、肾素分泌(Renin secretion)、神经营养素信号通路(Neurotrophin signaling pathway)、黄体酮介导的卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)、催产素信号通路(Oxytocin signaling pathway)等与不孕症治疗密切相关的生物反应信号通路上(图3)。

2.6 中药治疗不孕症方剂关键靶基因集蛋白互作网络组织表达分析

表3示，9味药物关键靶基因集包含基因28个。基于BioGRID数据库构建核心药物蛋白互作网络，发现该28个基因在人类蛋白互作网络中与1479个基因形成1930个关系对。对蛋白互作网络所包含的全部1507个基因进行组织表达分析，将蛋白质编码基因列表提交到David数据库，选择功能注释工具中的“组织表达”部分，应用 UP.TISSUE 进行蛋白质组织表达分析，分析结果为显著富集前10条(图4)。通过对显著富集的前10个表达位置可知，核心药组所包含的各个药物主要表达的身体部分有子宫、肾、垂体、脑、肝脏、皮肤、胎盘等。

3 讨论

中医学认为, 不孕症由肾虚(精血乏源、冲任不足)、肝郁(冲任不能相资)、脾虚(血脉失畅、气血不合)、瘀滞(瘀血阻滞冲任)、痰湿(痰湿阻滞胞宫)等多因素导致，与先天禀赋、后天环境、个人情志紧密相关[13-14]。由于病因病机复杂，目前对于其发生机制尚不明确。通过本次数据挖掘结果可知，中药治疗不孕症方剂核心药物组成为当归、香附、川芎、熟地黄、白芍、茯苓、甘草、人参、白术。研究表明，当归、白芍、熟地黄属补血药，功效以补血滋阴、益精填髓、养血调经、行气解郁为主；人参、甘草、白术属补气药，功效以复脉固脱、补脾益气、健脾安胎为主；川芎属活血药，功效以活血行气、逐瘀通经、引血下行为主；茯苓利水渗湿、健脾、宁心；香附疏肝解郁、理气宽中、调经止痛。可以看出，中医药治疗不孕症以补血、补气药为主，其次为活血化瘀药，并常辅以理气、利水消肿类药物。而这9味药物构成治疗不孕症的核心药组正是胜金丸(《医略六书》卷二十七)的基础方，另加桂心、白薇、延胡索即可成方。该方主治经迟不孕、脉虚者，具有补血滋冲任、养血营经脉、扶元补气、鼓运脾元、解郁调经、血气内充、解散寒滞之功效[5]。

中药的方剂应用构成了一种复杂的化学反应体系，其成分的纷繁复杂体现出中药药理作用的多组分、多靶点、多关联等特点[15]。在本研究中，不孕症核心药组9味中药经化学成分分析及ADME筛选后可知，各中药包含不同数量的化学成分，相同的化学成分也存在于不同的中药之中。如谷甾醇分别存在于当归、川芎、熟地黄、人参4味中药中，研究证实谷甾醇是一种具有较高营养价值与生物活性的植物甾醇, 在中枢神经系统的免疫调节、抗氧化、抗炎等方面具有一定的治疗功效[16]。同时，不同中药间具有相同的化学活性成分意味着其在人体药理作用中具有相同的靶点，而作用靶点的相同体现出中药治疗的“叠加作用”[17]，即在在同一个靶点上，不同的中药化合物之间可能发生协同作用，使原有各个血药浓度显效很低的中药药效进行叠加，进而达到必要的药效作用。核心药组9味中药间的多成分、多靶点相同，为进一步探究核心药组治疗不孕症的分子作用机理奠定了研究基础。

本研究采用网络药理学方法对核心药物作用靶点基因进行了网络作用机制研究，通过研究核心药物活性成分对应的靶蛋白和相互作用蛋白，分析各味中药所涉及的蛋白网络分子功能，以及通过探究核心药物共有靶蛋白互作网络组织表达位置，分析药物在人体内的表达作用情况。研究发现，核心药组可能通过信号传导、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、药物反应、细胞增殖的正调控、转录的正调控过程、ERK1和ERK2级联的正调控、细胞迁移的正调控等生物过程，并通过蛋白结合、蛋白质同源/异源二聚化活性、转录因子结合、受体结合、类固醇结合等分子功能发挥作用；其作用机制主要与雌激素信号通路(负责调节生殖系统和其他几种靶组织的生长，分化和功能[18])、催乳素信号通路(催乳素是一种多肽激素，广泛参与泌乳、生殖、内分泌和新陈代谢、大脑和行为以及免疫调节等[19])、肾素分泌(由肾小球旁(JG)细胞合成，参与细胞外液体积和体内血压稳态[20])、PI3K-Akt信号通路(参与许多细胞基本进程调控，其中包括细胞生长、转录、翻译、细胞增殖、细胞运动及糖原代谢[21])、神经活性配体-受体相互作用、氨基酸的生物合成、代谢途径等密切有关，其药物靶点主要存在于人体中的子宫、垂体、肝脏、肾、脑、胎盘等器官组织。有学者提出中医生殖轴理论，即由“心脑-肾气-天癸-冲任-胞宫轴”构成女性生殖轴，其对女性的生长、发育、生殖及衰老起主动作用[22-23]，不孕症方剂核心药物在体内的主要表达位置与该理论所描述的人体轴线相符合。

综上，本研究基于数据挖掘和网络药理学方法，挖掘中药治疗不孕症方剂核心药物，为探讨其作用机制提供科学依据，同时为其临床应用的有效性提供理论依据，也为探究具有多组分、多靶点、多途径等特点的中药复方治疗疾病的科学内涵提供新的研究思路。