真武汤治疗慢性心力衰竭的网络药理学研究❋

高 攀，张 姗，焦巨英，娄 妮，李 希，王幼平Δ

(1. 河南中医药大学第一临床医学院，郑州 450000； 2. 虞城县人民医院，河南商丘 476300； 3. 大连医科大学中西医结合研究院，辽宁大连 116044； 4. 大连医科大学检验医学院， 辽宁大连 116044)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是指持续存在的心力衰竭状态，是各种心脏疾病发展的终末阶段，随着年龄增长，其发病率呈上升趋势[1]。目前临床多采用正性肌力药、利尿剂、扩张血管等药物进行对症治疗，但效果不甚理想[2]。

真武汤源于《伤寒论》，由附子、生姜、白术、茯苓、白芍组成，具有温阳利水的功效，主要治疗阳虚水泛证，如心下悸动、小便不利、四肢沉重疼痛、浮肿、以腰以下为甚。有研究证明，真武汤结合西药治疗能明显改善慢性心力衰竭患者的临床症状[3]。虽然真武汤治疗慢性心力衰竭效果较好，但其作用机制的研究也仅局限于单个蛋白水平[4]，难以体现真武汤多成分、多靶标的作用机制及中医药整体性特点[5]。

随着生物信息学的发展，网络药理学为中医药系统性研究奠定了基础。网络药理学将系统的网络分析与药理学相结合，深入研究方剂中药与疾病之间的复杂机制[6]。同时网络药理学分析方法也体现了中药“多成分-多靶标”的作用特点，便于更好地理解中药之间的协同作用和进一步研究“中药-疾病”之间的关系。本研究通过对真武汤有效成分的筛选，预测相关靶标通路，以探讨真武汤治疗慢性心力衰竭的作用机制。

1 材料与方法

在本课题实验研究中，网络药理学分析方法总体来说可以分为以下几步：(1)真武汤中各味药物所含化学成分的数据库建立；(2)通过口服吸收利用度和药物相似性对成分进行筛选；(3)成分相关靶标的预测；(4)慢性心力衰竭相关靶标的搜索；(5)潜在靶标的选择，蛋白质相互作用关系网络的构建和通路分析(图1)。

1.1 数据库与软件

采用中药系统药理学分析平台数据库(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP) (http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、韩国传统知识门户数据库(korean traditional knowledge portal, KTKP) (http:∥www.koreantk.com/ktkp2014/)、有机小分子生物活性数据库PubChem (https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction数据库(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)、化学物质相互作用搜索工具(STITCH) (http:∥stitch.embl.de./)、蛋白质数据库 UniProt (https:∥www.uniprot.org/)、药物靶标数据库(therapeutic target database, TTD) (http:∥bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man, OMIM) (http:∥omim.org/)、基因疾病大集合数据库(DisGeNET) (http:∥www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)、人类基因数据库 GeneCards (https:∥www.genecards.org/)。网络可视化软件采用Cytoscape3.2.1 (http:∥www.cytoscape.org)；蛋白质互作网络数据库STRING (https:∥string-db.org/)、生物学信息注释数据库(database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID) (https:∥david.ncifcrf.gov/home.jsp, V6.8)、蛋白晶体结构数据库(PDB) (https:∥www.rcsb.org/)，在线系统分子对接(http:∥systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)。

图1 网络药理学分析流程图Fig.1 Workflow of network pharmacology analysis

1.2 真武汤成分的获取与数据库建立

通过计算系统生物学实验室平台 (TCMSP)[7]和韩国传统知识门户数据库 (KTKP)[8]，获取中药化学成分信息，建立真武汤化学成分数据库。化学结构等信息均使用PubChem进行确认。

1.3 药代动力学ADME 评价

所有成分均通过TCMSP数据库中纳入的ADME信息进行筛选，没有ADME信息的成分从数据库中删除。研究中使用ADME筛选标准为：口服生物利用度(OB) ≥30% 和 药物相似性(DL) ≥0.18[9]。

1.4 成分靶标预测

基于所筛选的成分，从PubChem数据库中得到成分相关的InChI Key、Canonical SMILES和CAS number。利用Swiss Target Prediction[10]和STITCH[11]数据库对成分进行靶标预测，种属设置为“Homo sapiens”，综合阈值得分≥0.4，基因名称、基因ID和种属等信息使用蛋白质数据库 (UniProt)[12]确认。

表1 真武汤中5种中药成分筛选比较

1.5 慢性心力衰竭相关疾病靶标的预测

以“慢性心力衰竭”为关键词，从OMIM 数据库[14]、DisGeNET 数据库[15]和GeneCards数据库[16]中获得疾病相关靶标，把上述4个数据库中得到的靶标汇总作为疾病靶标。

1.6 网络的构建

通过Cytoscape3.2.1[17]软件进行网络图的构建，在一个网络图中，“节点”可表示中药、成分、靶标、疾病、通路，“边”代表各个节点之间的相互作用关系，节点的“度”表示与之相连边的数目，节点的度值越大则说明这个节点在网络图中的重要性越大[18]。

1.7 潜在靶标的选择与分析

将成分靶标映射到慢性心力衰竭疾病靶标上，获得真武汤治疗慢性心力衰竭的潜在靶标，把潜在靶标输入蛋白质互作网络数据(STRING)获得蛋白-蛋白之间的相互关系(protein-protein interaction，PPI)，利用Cytoscape3.2.1构建PPI网络图。利用STRING[19]、DAVID[20]和KEGG数据库[21]对潜在靶标进行功能富集分析，进一步阐明真武汤的作用机制。设定种属为“Homo sapiens”，根据通路富集结果，以P<0.05作为显著功能的临界值，利用Cytoscape3.2.1构建中药-成分-靶标-疾病-通路的网络图。

1.8 分子对接

基于网络药理学分析结果，利用蛋白晶体结构数据库(PDB)获取蛋白结构，利用在线分子对接网站(Systems Dock)对相关靶标蛋白和成分进行分子对接。Systems Dock是一个基于网络药理学预测和分析的在线服务器，能够通过高精度对接模拟和分子路径图来全面描述配体选择性，并说明配体如何作用于复杂的分子网络。对接结果的分数是指实验解离/抑制常数值 (PKD/PKI) 的负对数, 分子对接分数值通常为0～10。

2 结果

2.1 成分获取

真武汤由白芍、白术、茯苓、附子和生姜5种中药组成。通过TCMSP和KTKP数据库查询共搜索到421个化合物，其中白芍126个，白术75个，茯苓35个，附子65个，生姜120个。

2.2 化合物筛选

“ADME”指机体对外源化学物吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)的过程。以药物代谢动力学为基础分析预测有助于理解分子机制。因此，利用药代动力学参数OB和DL值对化合物进行筛选。以OB ≥30% 和 DL ≥0.18筛选得到421个化合物中有73个符合标准。在这2个标准之外，五没食子酰葡萄糖(pentagalloylglucose)[22]、土莫酸(tumulosic acid)[23]和姜酚 (6-gingerol)[24]也作为活性成分进行后续分析，最终选择的化合物结果见表1。

2.3 化合物靶标的预测与网络构建

Swiss Target Prediction是一个在线服务器，能够与已知配体的二维和三维相似性测量相结合，精确预测生物活性分子的目标。STITCH整合了代谢途径和晶体结构，并结合实验和药物靶向关系的相互作用信息，利用表型效应、文本挖掘和化学结构相似性等信息进行预测。在Swiss Target Prediction和STITCH数据库中，预测的化合物和基因之间相互作用归因于“综合阈值得分”，分数越高表明相互作用越强，中药、成分、预测靶标和综合阈值得分如表2所示。删除重复之后，共有120个基因与16个已鉴定化合物之间的综合阈值得分≥0.4。根据预测结果构建化合物-靶标网络图(图2)，包括139个节点和178条边。

表2 化合物靶标预测比较

表3 潜在性靶标通路分析结果

注：蓝色四边形代表成分，红色椭圆形代表靶标图2 成分-靶标网络图

2.4 潜在靶基因的选择与分析

以“慢性心力衰竭”为关键词搜索疾病相关靶标，共得到8215个靶标结果。利用Cytoscape 3.2.1的merged功能选出成分靶标和疾病靶标的交集作为潜在靶标。以潜在靶标为核心，构建成分-潜在性靶标的网络图(图3)，此网络图由15个化合物和101个靶基因组成。图中山柰酚和53个靶标相连接，具有最高的度值。羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51A1)、雄激素受体(AR)、芳香化酶(CYP19A1)与5个以上成分相连，这些成分和靶标可能是网络图中的关键节点。

注：蓝色四边形代表成分，红色椭圆形代表靶标图3 成分-潜在性靶标网络图

利用STRING数据库对101个潜在性靶标进行分析，构建PPI网络筛选出靶标97个，在Cytoscape 3.2.1进行可视化处理(图4)。前列腺G/H 合成酶2 (PTGS2)、 表皮生长因子受体(EGFR)、雌激素受体(ESR1)、一氧化氮合酶(NOS3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)和基质金属蛋白酶(MMP9)，芳烃受体(AHR)、雄激素受体(AR)和芳香化酶(CYP19A1)拥有较高的度值。在PPI分析结果中，节点的平均度值为9.29，PPI enrichment p-value< 0.01，提示分析结果可靠性高[18]。

注：红色圆形代表潜在性靶标，度值和大小成正比图4 潜在性靶标相互作用关系 (PPI)网络图

为探究潜在性靶标功能，利用STRING和 DAVID数据库对潜在性基因进行功能富集分析(表3)，并建立中药-成分-靶标-疾病-通路的网络图(图5)，得到PI3K-Akt信号通路、胰岛素抵抗通路、PPAR 信号通路、雌激素受体信号传导等通路。目标基因主要涉及一氧化氮合酶(NOS3)、表皮生长因子受体(EGFR)、糖原合成酶激酶(GSK3B)和前列腺G/H 合成酶2 (PTGS2)等。

注：六边形代表中药，四边形代表成分，椭圆形代表靶标，三角形代表疾病，“V”形代表通路图5 中药-成分-潜在性靶标-通路-疾病网络图

2.5 系统分子对接

基于上述网络药理学分析结果，我们对11个靶标(AHR、AR、PTGS2、CYP19A1、CYP51A1、EGFR、ESR1、GSK3B、MMP9、NOS3、PPARG)和山奈酚进行分子对接(图6)。一般认为，分值大于4.25表示分子与靶标之间有一定的结合活性, 大于5.0表明有较好的结合活性, 大于7.0则说明结合活性很强[25]。这些结果表明，通过网络药理学筛选出的靶标均具有较好活性。

图6 分子对接得分

3 讨论

本文探讨了真武汤通过15个成分和97个潜在性靶基因发挥治疗慢性心力衰竭的作用。通过对潜在靶基因的功能富集分析得到可能作用的具体通路和主要涉及的目的基因NOS3、GSK3B、PTGS2等(图7)。

图7 真武汤中主要作用成分及靶标

通过网络的构建与分析，山柰酚在真武汤中的度值比较高，发挥的作用比较大。山奈酚是植物中提取的黄酮类化合物， 它可以从葡萄柚、花椰菜、蜂胶、金缕梅等植物中获得[26]。研究显示，含山奈酚的植物具有抗炎、抗氧化、抗血脂和抗癌的作用[27]。在研究山奈酚对异丙肾上腺素所致大鼠心肌损伤的影响中，通过对血流动力学、心肌梗死面积、心肌损伤标志物、脂质分布、氧化应激、促炎细胞因子和心、肝组织病理学等方面进行评估，结果山奈酚预处理的大鼠在心肌梗死面积和心率上均得到降低，同时血清LDH、CK-MB、肌钙蛋白和血脂水平也得到明显改善[28]。在慢性心力衰竭合并糖尿病的条件下，山奈酚可通过降低血糖、血清心脏标志物、氧化应激、炎症和细胞凋亡发挥治疗作用[29]。因此，山奈酚可作为治疗慢性心力衰竭方面的潜在药物。

在PPI网络图的主要靶基因中，前列腺素G/H合成酶2 (PTGS2/COX-2) 的度值最大，提示其在慢性心衰治疗中发挥着重要作用。长期使用COX-2选择性抑制剂会增加患者心血管事件(心力衰竭、高血压和心肌梗塞等)的发生风险[30]，所以COX-2在人类心脏病中的发展引起越来越多的关注。临床试验证明，昔布类药物能够抑制COX-2，降低炎症介质的产生，但同时也降低抗血栓前列腺素类的生成，使心血管事件发生率增加[31]。此外，心肌细胞特异性COX-2转基因模型对缺血/再灌注损伤具有保护作用[32]。研究表明，在异丙肾上腺素诱导大鼠心衰病程中加以中药的应用，可以通过调节COX-2发挥对心脏的保护作用[33]。

KEGG通路分析表明，PI3K-Akt信号通路具有最高的度值，可能是治疗机制中的重要通路。在生理刺激下，Akt的活化促进细胞的肥大[34]。据报道，PI3K/Akt活化可刺激MAPKs的磷酸化，在各种应激下诱导细胞内的各种基因转录，如诱导心肌细胞的炎症[35]。因此，PI3K/Akt是心脏肥大过程中的一个重要信号通路[36]。由于生理性肥大引起的短期AKT活化可能对心脏具有保护作用，但长期会造成病理性心脏肥大和心肌钙化，最终导致心力衰竭[37]。所以，阻断PI3K/Akt信号通路可能对缓解心脏肥大进展和压力超负荷引起的功能改变起到关键作用, 对慢性心力衰竭的防治具有重要意义[38]。

在通路分析中，除了PI3K-Akt信号通路之外，PPAR 信号通路也具有较高的度值，发挥着治疗慢性心力衰竭的重要作用。作为核激素受体超家族中的配体激活转录因子，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)由PPARα、PPARγ 和PPARβ/δ 组成[39]。PPAR 根据其组织分布不同而具有不同的生理功能[40]。其3种亚型都在心肌细胞中表达，并且与脂质代谢和能量平衡的调节以及心脏方面密切相关[41]。然而，PPARα/γ 激动剂有较多不良反应而未能应用于临床[42]。在自发性高血压大鼠模型的研究中，中医药能够改善线粒体超微结构损伤，恢复PPARα和PPARγ 表达水平，发挥对自发性高血压大鼠心脏重塑和功能障碍的保护作用[43]。可见，PPAR是中医药治疗慢性心力衰竭的潜在治疗靶标，在药物开发中应该充分发挥中医药优势，开发出更安全、更有效的PPAR激动剂。

多项研究表明，网络药理学研究可以阐明中药“多成分-多靶标”的作用特点。本研究经过网络药理学分析预测发现，真武汤主要通过活性化合物(山奈酚)的靶标(PTGS2等)调节机制和PI3K-Akt、PPAR 等信号通路，发挥治疗慢性心力衰竭的作用，不仅为本课题的研究提供了新的方向，也为其他方剂的研究提供参考。