附子理中汤对非酒精性脂肪肝细胞模型脂肪沉积的影响与相关机制研究❋

杨家耀，易宏锋，廖 艳，舒 磊，杜念龙，陈 露，黎晨玉，安 柳，邹 琦，时昭红△

(1. 武汉市第一医院消化内科，武汉 430022； 2. 湖北中医药大学， 武汉 430065)

随着人们生活水平的提高，饮食的不规律性，以肝内脂肪过度沉积为主要临床特征的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成为一种发病率较高的疾病，对人们的健康产生极大威胁[1-3]。近些年，中医因整体思维及辨证论治优势，在NAFLD的理论、临床及实验研究中均取得了大量的成绩。中医疗法治疗NAFLD主要有单味药及其有效成分、中药复方、针灸及推拿等[4]。其中通过临床研究表明，一些中药复方对治疗NAFLD疗效较为显著[5-6]。过往中药复方治疗NAFLD的研究主要集中于临床及动物水平，而细胞水平的研究还相对较少。本课题前期成果已证明，3种汤药中附子理中汤对NAFLD的作用效果最佳，但尚未深入探究其具体作用机制[7]。本研究在前期研究的基础上，拟通过细胞水平实验揭示附子理中汤对NAFLD的作用机制，为临床治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞来源及培养：正常人肝细胞株HL-7702购自中国科学院细胞库(货号GNHu6)。细胞经复苏后，培养于含10% FBS、100 U/ml PNC以及100 mg/ml链霉素的DMEM中。细胞在常规条件下培养至80%融合，洗涤、收集细胞继续培养用于后续造模实验。

1.2 主要药物及试剂

中/长链脂肪乳注射液(货号C6-24)购自华瑞制药有限公司；附子理中汤出自《三因极一病证方论》卷二中寒治法，按传统方法制备煎煮液浓缩后备用(所有药物在使用时均采用无血清培养基稀释至指定浓度)；Human INF-α ELISA Kit(货号HM10251)、Human INF-β ELISA Kit(货号HM10099)和Human IL-10 ELISA Kit(货号HM10203)购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；兔一抗Toll样受体4(TLR4；货号ab13867；稀释比：1∶1000)、兔一抗肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3；货号ab36988；稀释比：1∶1000)、兔一抗TRIF相关的接头分子(TRAM；货号ab96106；稀释比：1∶1000)、兔一抗干扰素调节因子3(IRF3；货号ab25950；稀释比：1∶1000)、兔一抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH；货号ab9485；稀释比：1∶2500)及辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(货号ab97051；稀释比：1∶5000)均购自英国Abcam公司。

1.3 实验方法

1.3.1 非酒精性脂肪肝细胞模型构建及药物处理 本研究采用1 ml/l的脂肪乳剂加入正常DMEM培养肝细胞建立NAFLD模型[8]。取对数生长期的HL-7702细胞，以104/孔接种培养于12孔板，设置正常培养基为对照组；含1 ml/l的脂肪乳剂的培养基为模型组；采用培养基稀释的高(1.5 g/ml)、中(1 g/ml)、低(0.5 g/ml)附子理中汤及易善复(5 μmol/l)预先处理细胞1 h，后不经洗涤直接加1 ml/l脂肪乳剂继续培养细胞制造非酒精性脂肪肝细胞模型。每组按培养时间不同，每间隔12 h细分一小组，共12 h、24 h、36 h和48 h 4个小组，每小组设置3重复。

1.3.2 MTT法检测细胞活力 MTT法检测细胞活力，严格按照相关试剂盒进行操作处理样本，最后在酶标仪上测量吸光度(OD)并记录。

1.3.3 油红O染色 分别于上述分组对应时间点取各组细胞少许，弃尽细胞培养基，PBS清洗一遍；10%甲醛固定10 min，同时将油红O染液置于60～65 ℃恒温箱中预热；用PBS漂洗细胞2次，加入预热后的油红O染液，并置于60～65 ℃恒温箱中反应15 min；80%丙二醇分化2～5 min，在显微镜下观察至背景接近无色位置；用PBS漂洗细胞3次，镜检、拍照并记录。单独收集48 h的各组细胞约1.0×104个，PBS洗净细胞表面油红O；每组加200 μL异丙醇抽提细胞内的油红O，离心收集上清液，然后在510 nm波长下测定OD值，每组OD值代表该组细胞积累的脂肪定量值并统计分析。

1.3.4 生化检测及炎症因子水平检测 细胞培养48 h后分别收集各组细胞的培养上清液分成两份，一份经全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)及甘油三酯(triglyceride，TG)含量，同时检测胎牛血清中上述3指标水平，排除培养基血清中各指标潜在含量对本实验数据的干扰；另一份根据ELISA试剂盒说明书操作分别检测干扰素-α(Interferon alpha，INF-α)、干扰素-β(Interferon beta，INF-β)和白介素-10(Interleukin-10，IL-10)的分泌水平。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI双染检测各组细胞凋亡水平 取培养48 h的各组细胞，后根据Annexin V-FITC/PI双染试剂盒操作检测各组细胞凋亡率，总凋亡率为第二象限与第四象限细胞占比之和。

1.3.6 qRT-PCR检测各组细胞中TLR4、TRAM、TRAF3及IRF3的表达水平 根据NCBI公布的人TLR4、TRAM、TRAF3、IRF3及内参基因GAPDH序列分别设计qRT-PCR用引物：TLR4 F/R：5'-ACCTGTCCCTGAACCCT-3'，5'-CTCCCAGAACCAAACGA-3'；TRAM F/R：5'-TGTGGCAGACAGCATT-3'，5'-TGTGGCAGACAGCATT-3'；TRAF3 F/R：5'-AGGGTCTACCTGAACGG-3'，5'-GGGTCGGGCTTGAATG-3'；IRF3 F/R：5'-CAAGAGGCTCGTGATGG-3'，5'-TGTACTGGTCGGAGGTGA-3'及GAPDH F/R：5'-CCACTCCTCCACCTTTG-3'，5'-CACCACCCTGTTGCTGT-3'，上述引物由上海生工合成。qRT-PCR采用常规方法进行，选取GAPDH为内参基因，采用2-△△CT算法计算基因的相对表达量。

1.3.7 Western blot检测TLR4、TRAM、TRAF3及IRF3蛋白表达量 Western blot实验具体操作步骤参考本课题组前期发表文献[9]。选取GAPDH为内参蛋白，后采用Quantity One图像分析软件进行半定量分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 附子理中汤促进NAFLD模型细胞增殖活性

图1示，与同组12 h比较，对照组细胞24 h、36 h及48 h OD值均显著增加(P<0.01)，模型组细胞仅48 h OD值显著增加(P<0.01)；高剂量FZLZD组及YSF组细胞24 h、36 h及48 h OD值均显著增加(P<0.01)，中、低剂量FZLZD组细胞36 h及48 h OD值均显著增加(P<0.05，P<0.01)。与同时间点对照组比较，模型组细胞OD值均显著降低(P<0.01)，与同时间点模型组比较，各治疗组细胞OD值均呈不同程度显著增加(P<0.05，P<0.01)，其中以高剂量FZLZD组及YSF组细胞OD值变化最明显。

注：FZLZD：附子理中汤；YSF：易善复；与同组12 h比较：*P<0.05，**P<0.01；与同时间点对照组比较：##P<0.01；&&P<0.01图1 不同时间点各组细胞OD值变化

2.2 附子理中汤抑制NAFLD模型细胞与脂肪沉积

图2示，对照组细胞边缘清晰，多为多角形或梭形，呈铺路石样排列，细胞间结合紧密、间隙小、细胞核大且胞内极少见红色脂滴；而模型组细胞内出现明显红色脂滴，部分细胞内脂滴成环状位于细胞膜内侧且将细胞核挤向一侧，细胞多呈圆形，细胞间结合较松散，且随着时间推移松散程度进一步加大，脂滴更大更集中；而各药物干预组细胞内脂滴积累情况呈现不同程度的缓解，且随时间推移，脂滴含量逐渐减少且细胞结合趋于紧密，其中尤以高剂量附子理中汤和易善复组细胞变化最为显著。

2.3 附子理中汤降低NAFLD模型细胞ALT、AST及TG释放量

表1示，各组细胞培养上清液的生化检测结果显示，与对照组比较，胎牛血清中ALT、AST及TG含量差异显著(P<0.01)，提示ALT、AST及TG的来源主要为细胞代谢，而非培养基血清本底。同时与对照组比较，模型组细胞上清液中ALT、AST及TG含量均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，附子理中汤呈一定剂量依赖性地降低ALT、AST及TG含量(P<0.01)，其中以高剂量附子理中汤及易善复组变化最为显著。

2.4 附子理中汤提高NAFLD模型细胞INF-α、INF-β和IL-10分泌水平

表2示，与对照组比较，模型组细胞上清液中INF-α、INF-β和IL-10的分泌水平均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，附子理中汤呈一定剂量依赖性地提升INF-α、INF-β和IL-10的分泌水平(P<0.01)，其中以高剂量附子理中汤及易善复组变化最为显著。

2.5 附子理中汤降低NAFLD模型细胞凋亡率

图3示，与对照组比较，模型组细胞的总凋亡率显著增加(P<0.01)；与模型组比较，附子理中汤呈一定剂量依赖性地降低细胞的凋亡水平(P<0.01)，其中以高剂量附子理中汤及易善复组变化最为显著。

2.6 附子理中汤调控NAFLD模型细胞TLR4/TRAM/TRAF3信号通路

图3示，TLR4/TRAM/TRAF3信号通路关键靶标mRNA及蛋白表达水平检测结果显示，相较于对照组，模型组细胞TLR4在mRNA水平表达显著增加(P<0.01)，而TRAM、TRAF3及IRF3表达水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，除低剂量附子理中汤组外，其余各治疗组细胞TLR4表达水平显著降低(P<0.01)，而TRAM、TRAF3及IRF3表达水平显著升高(P<0.01)，其中以高剂量附子理中汤及易善复组变化最为显著。在蛋白水平与对照组比较，模型组细胞TLR4蛋白水平显著增加(P<0.01)，提示TLR4被激活，而TRAM、TRAF3及IRF3蛋白水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组细胞TLR4蛋白水平显著降低(P<0.01)，而TRAM、TRAF3及IRF3蛋白水平显著升高(P<0.05，P<0.01)，其中以高剂量附子理中汤及易善复组变化最为显著。

3 讨论

近年来，“二次打击”学说作为NAFLD的经典发病机制已被广泛接受。脂类在肝脏细胞的细胞质内过度聚集(一次打击)会触发一系列细胞毒性反应(二次打击)，导致肝脏炎症反应[10]。NAFLD发病相对隐匿，且发病过程中的每个程序都不是独立的，他们彼此间互为因果、交互影响；而中医药讲究辨证论治，即综合分析各相关因素遣方用药，这更符合NAFLD的病因病机[11]。研究组前期细胞水平实验已证明，附子理中汤能有效促进NAFLD细胞的增殖并抑制其凋亡，但附子理中汤与调控脂质积累诱发的过度炎症反应是否有关尚不清楚。

注：A.不同时间点各组细胞油红O染色结果(×200)；B.48 h各组细胞内脂肪积累定量结果；箭头所示为典型的脂肪积累位置；FZLZD：附子理中汤；YSF：易善复；对照组比较：**P<0.01；模型组比较：#P<0.05，##P<0.01图2 不同时间点各组细胞油红O染色及48 h脂肪积累定量比较

表1 各组细胞培养上清液中ALT、AST及TG含量比较

表2 各组细胞培养上清液中INF-α、INF-β和IL-10分泌水平比较

注：A.流式检测细胞凋亡，总凋亡细胞占比为二象限和四象限细胞占比之和；B.总凋亡率统计；FZLZD：附子理中汤；YSF：易善复；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01图3 各组细胞凋亡水平检测

注：A.mRNA水平表达定量；B.SDS-PAGE电泳；C.蛋白水平表达定量；FZLZD.附子理中汤；YSF：易善复；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01图4 各组细胞TLR4/TRAM/TRAF3信号通路关键靶标表达水平检测

中医学认为NAFLD的治疗应以温阳化气为主，恢复其脾胃功能[12]。本研究所拟附子理中汤主要成分干姜与炮附子分别具有温运健脾、回阳救逆的功效；且实验结果显示，其能呈浓度依赖性地促进NAFLD模型细胞的增殖活性，抑制NAFLD模型细胞的凋亡，降低脂肪沉积能力，有效降低肝细胞因脂质积累过多而释放的ALT、AST及TG水平。此外，本方还含有中药人参，其主要成分人参皂苷被证明通过抗氧化发挥保肝护肝作用[13]。本方中的白术在治疗NAFLD上早有临床报道。王峰发现，采用参苓白术散加味治疗NAFLD疗效显著，且有效改善患者血脂情况[14]；而孟胜喜等采用含白术多糖的复方对高脂饮食诱导大鼠NAFLD进行治疗，发现其主要通过抑制肝脏脂肪合成发挥保肝作用[15]。实际临床谭茂卿等从“治未病”思路出发，证明附子理中汤近期可降低血脂和转氨酶，改善临床症状，远期可调节人体代谢功能改变体质[16]。

本研究同时发现，附子理中汤还能通过抑制TLR4表达，活化TRAM/TRAF3通路，上调抗炎因子INF-α、INF-β和IL-10分泌水平。TLR4是Toll样受体家族(TLRs)中发现最早且研究最清楚的一员，其广泛存在于多种免疫细胞的表面[17]。TLR4与配体结合后主要通过活化髓样分化因子88(MyD88)依赖性和非依赖性信号途径，激活一系列的炎症和免疫反应[18]。其中TLR4介导的MyD88依赖性信号通路已被证明为多种中药治疗NAFLD的有效靶点，但TLR4介导的MyD88非依赖性信号通路与NAFLD的相关性研究还十分少见[19]。TLR4介导的MyD88非依赖性信号传导途径的主要接头蛋白为TRAM和TRIF，TLR4通过招募TRAM/TRIF，激活另一些蛋白酸磷化激酶(如TBK1、IKKs/IKKi)，导致转录因子干扰素调节因子3(IRF3)激活并入核，以诱导IFN-α、IFN-β的转录最终引起免疫反应[20]。在Th1活化的研究中发现，TLR信号通路中TRAF6上调可促进Th1活化，而TRAF3上调则引起相反的作用，TLR4介导的MyD88/TRAF6途径以及MyD88非依赖途径(TRIF依赖性途径)在调节免疫细胞活化中存在一定的拮抗作用[21]。而我们发现，附子理中汤呈剂量依赖性地抑制TLR4表达，且激活TRAM/TRAF3信号通路，进而触发INF-α、INF-β和IL-10等抗炎因子的表达，在炎症反应后期发挥炎症损伤修复作用。由此可见，TLR4介导的TRAM/TRAF3信号通路在NAFLD的发生中扮演着不可或缺的角色，TLR4/TRAM/TRAF3信号通路可作为附子理中汤的有效作用靶点。

综上所述，本研究揭示中药附子理中汤能显著降低NAFLD模型细胞脂肪沉积能力，缓解炎症反应，这可能与附子理中汤对TLR4/TRAM/TRAF3信号通路的有效调节密切相关。后期我们将从动物水平及临床试验出发，进一步验证附子理中汤治疗NAFLD的有效性及其他潜在机制，为NAFLD的治疗提供更多可靠的思路。