车前草浸出物测定方法的建立及熵权TOPSIS法评价车前草药材质量

田甜，纪玉华，王寿富，陈丹燕，刘远俊，程学仁

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山528244）

车前草是车前科植物车前Pl antago asiaticaL.或平车前Plantago depres saWilld.的干燥全草，始载于《神农本草经》[1]，性寒、味甘，归肝、肾、肺、小肠经，主要功效为清热利尿通淋、祛痰、凉血、解毒[2]。现代药理研究表明，车前草具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、降血脂、降血尿酸等作用[3⁃6]。车前Planta go asi at i caL.主产于江西、四川、安徽、江苏等地[7]，主要含有黄酮及其苷类、生物碱类、苯乙醇苷类、三帖类、甾醇类、多糖类、环烯醚萜类等化学成分[8⁃9]，其中黄酮类、苯乙醇苷成分是车前草的主要活性成分。目前,车前草的相关研究主要集中在化学成分、药理活性、提取等方面，关于浸出物的研究未见报道。2020年版《中国药典》一部车前草项下仅规定以热浸法测定水溶性浸出物含量限度。本研究以全国4个主产地的车前草为研究对象，建立车前草浸出物特征图谱，并测定浸出物质量分数、特征图谱共有峰总面积及大车前苷、木犀草苷和车前草苷D 3个指标成分的质量分数。

层次分析法是一种定性和定量相结合的、层次化的分析方法，它通过数理运算将人们主观上对各项指标的重视程度与各项指标之间的相互联系转变为可量化的权重系数，实现主观重要因素与问题的决策性分析[10⁃11]。熵权TOPSIS法是根据评价对象与理想化目标的接近程度进行顺序优选的一种多指标决策分析方法，能够客观地反映各指标的相对重要程度，提高指标综合评价结果的真实性和可靠性，但要求样本数量尽可能多[12]。本研究结合层次分析法、熵权TOPSIS法优选车前草浸出物的最佳测定方法，在一定程度上减少了主观因素对问题决策的影响，也扩大了熵权法的利用范围[11,13⁃14]。此外，通过熵权TOPSIS法对不同产地车前草浸出物进行综合评价，以期进一步完善车前草药材的质量控制，建立更加全面的车前草质量评价方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

H⁃Class型沃特世液相色谱仪（沃特世仪器公司）；ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平（梅特勒⁃托利多仪器有限公司）；HWS28型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司）；Milli⁃Q⁃Di⁃rect超纯水系统（默克股份有限公司）；KQ⁃700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG⁃9147A型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 材料

大车前苷（批号：111914⁃201604，质量分数90.2%）、木犀草苷（批号：111720⁃201609，质量分数94.9%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；车前草苷D对照品（批号：147331⁃98⁃4，质量分数98.0%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；乙醇为分析纯（天津富宇精细化工有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯（默克股份有限公司），磷酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水（Milli⁃Q Direct超纯水）。

10批车前草药材经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定，均为车前科植物车前Plant a go asiaticaL.的干燥全草，具体见表1。

表1 车前草药材样品信息Table 1 Information of Plant ago asiatica L.samples

2 方法与结果

2.1 浸出物测定方法

2.1.1 冷浸法 称取车前草药材（S4）供试品适量，粉碎（过2号筛），取约4 g，精密称定，分别置250 mL锥形瓶中，分别加水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇各100 mL（每种溶剂平行测定3份），称定质量，按2020年版《中国药典》通则2201项下浸出物测定法中的冷浸法测定，依次计算浸出物质量分数，结果见表2。

2.1.2 热浸法 称取车前草药材（S4）供试品适量，粉碎（过2号筛），取约4 g，精密称定，分别置250 mL锥形瓶中，分别加水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇各100 mL（每种溶剂平行测定3份），称定质量，按2020年版《中国药典》通则2201项下浸出物测定法中的热浸法测定，依次计算浸出物质量分数，结果见表2。

结果表明，热浸法下，车前草浸出物质量分数均高于同水平下冷浸法，不同浸提溶剂浸出物质量分数排序为水＞50%乙醇＞75%乙醇＞95%乙醇。

表2 不同浸提方法车前草浸出物质量分数测定结果Table 2 Determination of Plantain extract by different extrac⁃tion methods(n=3) w/%

2.2 车前草浸出物特征图谱的建立及3种成分质量分数的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；流动相：乙腈（A）⁃0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，12%～13%A；5～15 min，13%～17%A；15～20 min，17%A；20～25 min，17%～88%A；25～26 min，88%～12%A；26～35 min，12%A）；检测波长：330 nm；柱温：30℃；流速：0.30 mL/min；进样量：1μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取大车前苷、木犀草苷、车前草苷D对照品适量，精密称定，加60%甲醇分别制成402.65、51.36、32.10μg/mL的混合对照品储备液。分别量取对照品储备液1、2、4、6、8 mL置10 mL量瓶中，用60%甲醇定容，得到系列浓度的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 分别取“2.1”项冷浸法和热浸法续滤液，即得供试品溶液。

2.2.4 浸出物特征图谱的建立

2.2.4.1 精密度试验 取车前草药材（S1），按“2.1.2”项以75%乙醇为溶剂制备浸出物，按“2.2.3”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件连续进样6次，以大车前苷色谱峰作为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.1%，相对峰面积RSD值均小于1.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 稳定性试验 取车前草药材（S1），按“2.1.2”项以75%乙醇为溶剂制备浸出物，按“2.2.3”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，以大车前苷色谱峰作为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.5%，相对峰面积RSD值均小于2.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.4.3 重复性试验 取车前草药材（S1）6份，按“2.1.2”项以75%乙醇为溶剂制备浸出物，按“2.2.3”项平行制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进行测定，以大车前苷色谱峰作为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.1%，相对峰面积RSD值均小于2.7%，表明方法重复性较好。

2.2.4.4 车前草浸出物HPLC特征图谱的建立 取车前草药材10批，按“2.1.2”项以75%乙醇为溶剂制备浸出物，按“2.2.3”项制备供试品溶液，“2.2.1”项色谱条件进行测定，记录色谱图。将数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版），建立10批车前草浸出物的特征图谱，经系统自动匹配，生成对照图谱。共标定了7个共有峰，基于前期实验室车前草的化学成分指认[15]，确定4号峰为大车前苷，5号峰为木犀草苷，6号峰为车前草苷D。HPLC叠加色谱图及对照图谱R见图1。以车前草浸出物对照图谱R为参照，进行整体相似度评价，结果显示10批车前草浸出物特征图谱相似度均大于0.99，与对照指纹图谱具有较好的一致性，表明药材批间差异较小，质量稳定性较好。

图1 10批车前草浸出物HPLC特征图谱叠加图Figue 1 HPLC characteristic spectrum overlay of 10 batches of Plantain extract

2.2.4.5 不同浸提方法的特征图谱峰峰面积 取车前草药材同一供试品（S4），按“2.1”、“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录不同浸提方法的特征图谱共有峰峰面积。结果表明，以水为提取溶剂的冷浸法提取得到的供试品中，无法检测出木犀草苷、车前草苷D和峰7。热浸法下，车前草浸出物的特征图谱总峰面积均高于同水平下冷浸法浸出物，浸出物的特征图谱总峰面积顺序为75%乙醇＞50%乙醇＞95%乙醇＞水。不同浸提方法的特征图谱共有峰峰面积见表3。

表3 不同浸提方法特征图谱共有峰峰面积Table 3 Common peak area of characteristic spectrum of Plantain extract by different extraction methods(n=3)

2.2.5 3种指标成分质量分数的测定

2.2.5.1 线性关系考察 取系列混合对照品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样测定，以对照品溶液的质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到大车前苷、木犀草苷、车前草苷D的线性回归方方程分别为Y=278 042 X-235 6、Y=398 519 X-7 948、Y=284 175 X-4 846，r2分别是0.999 9、0.999 8、0.999 7，表明大车前苷、木犀草苷、车前草苷D质量浓度分别在40.3～322.1、5.1～41.1、3.2～25.7μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.5.2 精密度试验 取车前草药材（S1），按“2.1.2”项以75%乙醇为溶剂制备浸出物，按“2.2.3”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件连续进样6次，计算得到大车前苷、木犀草苷、车前草苷D峰面积RSD值分别为1.3%、1.5%、0.7%，表明仪器精密度良好。

2.2.5.3 稳定性试验 取车前草药材（S1），按“2.1.2”项以75%乙醇为溶剂制备浸出物，按“2.2.3”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算得到大车前苷、木犀草苷、车前草苷D峰面积RSD值分别为1.3%、1.0%、1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5.4 重复性试验 取车前草药材（S1）6份，按“2.1.2”项以75%乙醇为溶剂制备浸出物，按“2.2.3”项平行制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算得到大车前苷、木犀草苷、车前草苷D质量分数均值分别为0.9%、0.2%、0.05%，其RSD分别为0.2%、0.2%、0.1%，表明方法重复性较好。

2.2.5.5 加样回收率试验 称取已知含量的车前草药材粉末（S1）9份，每份1.0 g，精密称定，按对照品加入量与所取药材供试品中待测定成分量之比0.5∶.5∶1精密加入大车前苷、木犀草苷、车前草苷D对照品，按“2.1.2”项以75%乙醇为溶剂制备浸出物，按“2.2.3”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得到大车前苷、木犀草苷、车前草苷D的加样回收率均值分别为96.8%、95.6%、94.0%，RSD值分别为2.1%、3.1%、1.5%，表明该方法准确度良好。

2.2.5.6 最低检出限、最低定量限试验 将混合对照品溶液稀释至低浓度，以信噪比S/N≧3时确定大车前苷、木犀草苷、车前草苷D的最低检出限（LOD）依次为23.9、19.9、25.8 ng/mL，以信噪比S/N=10时确定大车前苷、木犀草苷、车前草苷D的最低定量限（LOQ）依次为7.2、6.0、7.7 ng/mL。

2.2.5.7 质量分数的测定 取车前草同一供试品溶液（S4），按“2.1”、“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，计算供试品中大车前苷、木犀草苷、车前草苷D的质量分数，结果见表4。可见，不同浸提方法下，大车前苷质量分数最高，对总质量分数的影响最大。

2.3 层次分析法结合熵权TOPSIS法评价车前草浸出物提取方法

2.3.1 层次分析法对各考察指标主观赋权 层次分析法是一种综合主观判断，使定性与定量分析有机结合，将结构复杂、决策准则多且不易量化的问题分解成一个简单明了的多层分析结构模型的方法[10]。本研究以浸出物质量分数、特征图谱特征峰总峰面积和指标成分的总质量分数为指标层，建立车前草浸出物提取方法判断矩阵（见表5），权重系数采用AHP层次分析法yaahp V10软件处理，得到各指标权重系数wj依次为0.346 9、0.454 6、0.198 5。

2.3.2 熵权TOPSIS法对各考察指标客观赋权 熵权TOPSIS法根据各项指标测得值的大小来确定指标权重，能客观、全面反映各指标的相对重要程度，保证结果的准确性[12]。以浸出物质量分数、3个指标成分总质量分数、特征峰总峰面积原始数据为初始决策矩阵，根据公式（1）、（2）将矩阵转化为标准化决策矩阵，i为样本数（i=1，2，…，m），j为评价指标（j=1，2，…，n）；根据公式（3）计算不同浸提方法对各评价指标的熵值Ej依次为0.785 6、0.862 3、0.833 6；再根据公式（4）对熵值进行处理，得到各指标权重系数vj依次为0.413 6、0.265 5、0.320 9。

表4 不同浸提方法下指标成分质量分数的测定结果Table 4 The index component content of Plantain extract by different extraction methods(n=3 w/%

表5 车前草浸出物提取方法判断矩阵表Table 5 Judgment matrix of extraction method of plantain extract

2.3.3 组合赋权 在浸提方案优选上，层次分析法受主观因素的干扰，无法很好地客观反映事实；熵权法虽能客观反映事实，但要求样本数量尽可能多。将层次分析法与熵权法结合求组合权重，在一定程度上减少了主观因素对方法决策的影响，也扩大了熵权法的利用范围[11,13⁃14]。根据公式（5），计算得到浸出物质量分数、3个指标成分总质量分数、特征峰总峰面积的权重系数Wj分别为0.387 1、0.355 0、0.257 9。其中，α取0.5。

2.3.4 车前草浸出物提取方法综合评价 以浸出物质量分数、特征图谱特征峰总峰面积及3个指标成分总质量分数为评价指标，结合组合权重系数Wi对提取工艺进行综合评价。综合评分值=浸出物质量分数/浸出物最大质量分数×100×W1+3种指标成分总质量分数/3种指标成分总质量分数的最大值×100×W2+特征峰总峰面积/特征峰总峰面积最大值×100×W3。车前草浸出物综合评价结果见表6。结果表明，以热浸法、75%乙醇为溶媒的综合评分最高，排名第一。故优选车前草浸出物测定方法为：以75%乙醇为溶媒，按醇溶性浸出物测定法（2020年版《中国药典》通则2201）项下的热浸法测定。

2.4 熵权TOPSIS法分析不同产地车前草药材质量

取不同产地的10批车前草药材，以热浸法、75%乙醇为溶剂制备浸出物，计算车前草浸出物质量分数、3个指标成分质量分数及特征图谱各共有峰峰峰面积，结果见表7、8。熵权TOPSIS法通过计算各指标对最优方案的贴近度，实现多目标决策分析，贴近度越大，越贴近理想值，被评价事物越优[11]。以不同产地车前草浸出物为原始数据，建立初始决策矩阵，根据计算公式（1）～（4）计算得到每个指标的权重系数；根据公式（6）确定加权决策矩阵Z；根据公式（7）、（8）计算得出最优方案Z+与最劣方案Z-，再根据公式（9）计算每个样品与最优最劣方案的距离D，得到最优解的欧氏贴近度Ci，并进行排序，结果见表9。

表6 车前草浸出物提取方法综合评价结果Table 6 Comprehensive evaluation results of extraction method of Plantain extract

表7 10批车前草浸出物及3个指标成分的质量分数测定结果Table 7 Determination of 10 batches of Plantain extract and 3 index components（n=2） w/%

表8 10批车前草浸出物特征图谱共有峰峰面积Table 8 Common peak area of 10 batches of Plantain extract（mAu，n=2）

可见，江苏、江西、四川、安徽4省车前草浸出物的平均Ci值分别为0.604 1、0.650 6、0.258 8、0.477 6，表明江苏、江西两省所产车前草药材浸出物接近，质量优于四川、安徽两省的车前草。

3 讨论

车前草是临床上常用的一味传统中药，其药用历史悠久，药源丰富。2020年版《中国药典》仅规定车前草热浸法下的水溶性浸出物含量，对车前草醇溶性浸出物含量未进行规定。本研究以水和不同比例的乙醇为溶剂，采用冷浸、热浸2种方式进行提取，结果显示浸出物各指标结果在不同提取条件下均存在明显差异。以水为溶媒提取的浸出物质量分数虽高，但指标成分质量分数和特征图谱共有峰总面积最低，且实验过程中过滤速度较慢，不利于操作；以95%乙醇为溶媒提取的浸出物质量分数最低，有效成分提取不完全；50%乙醇和75%乙醇提取出的浸出物质量分数、指标成分总质量分数、特征图谱共有峰总峰面积差异不明显。

编号S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10产地江苏省江苏省江苏省江西省江西省四川省四川省四川省安徽省安徽省Di+0.162 8 0.132 4 0.118 5 0.153 9 0.077 7 0.232 0 0.209 0 0.314 0 0.158 2 0.194 6 Di⁃0.194 6 0.221 2 0.212 6 0.169 3 0.271 2 0.125 4 0.154 8 0.000 0 0.170 3 0.150 9 Ci 0.544 5 0.625 6 0.642 1 0.523 9 0.777 2 0.350 9 0.425 5 0.000 0 0.518 5 0.436 7排名43251981 067

本研究考虑到中药有效成分的现代药理学作用，认为指标成分总质量分数、浸出物质量分数、特征图谱共有峰总面积较为重要，人为因素影响较大，所得权重系数具有一定主观性。熵权TOPSIS法的权重系数完全依据客观的实验数据，能真实反映提取制备过程中各指标变化规律，但所需样本数量大，忽略了中药化学成分的复杂性。本研究运用层次分析法和熵权TOPSIS法对多项指标进行组合赋权，既综合了车前草中有效成分的药理作用，又能体现中药化学成分复杂性的特点，主观赋权与客观赋权结合，所得工艺更科学、合理。

在此基础上，根据优选的浸出物测定方法，对不同产地的10批车前草药材浸出物进行测定，运用熵权TOPSIS法对各指标进行客观评价，结果显示产自江苏、江西两省的车前草浸出物质量接近，优于安徽、四川两省的车前草，为优选车前草产地提供了实验依据。

本研究建立的车前草药材浸出物及特征图谱测定方法，全面反映了车前草提取程度、量和质的整体信息，为进一步完善车前草药材的质量评价提供了理论依据。