山茱萸炮制前后的UPLC特征图谱研究

林碧珊，陈锦霞，史紫娟，陈科成，曾杉

（国药集团广东环球制药有限公司，广东佛山528305）

山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）是山茱萸科山茱萸属植物的成熟干燥果肉［1］，主产于我国安徽、陕西、浙江、河南等省。山茱萸具有补益肝肾、涩精固脱的作用，主要用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症［2⁃4］。山茱萸的主要成分包括环烯醚萜苷类、有机酸及其酯类、五环三萜类、鞣质、多糖等，主要的苷类成分有山茱萸苷、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷及山茱萸裂苷等，其中莫诺苷和马钱苷是山茱萸中最主要的环烯醚萜苷类成分［5⁃7］。

目前，《中国药典》中尚无区分山茱萸生品和炮制品的鉴别内容，而文献对山茱萸的研究多集中在其化学成分、药理作用及含量测定上，对炮制前后药材指纹图谱的差异没有系统分析方法，不能完整反映真实质量，缺乏综合有效的评价标准［8］。采用中药指纹图谱可以较全面反映中药材及其饮片所含成分的真实情况，适用于中药的鉴别和质量控制，本研究通过考察不同产地山茱萸炮制前后特征图谱的变化，为山茱萸饮片在加工炮制过程中的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

H⁃class UPLC高效液相色谱仪（PDA二极管阵列检测器，美国Waters公司）；AL104型电子天平（梅特勒⁃托利多公司）；KQ⁃500DE型数控超声清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；M MILLIPORE Syner⁃gy UV超纯水仪（美国默克公司）。

1.2 试药

对照品：莫诺苷（中国食品药品检定研究院，批号：111998⁃201602）；马钱苷（中国食品药品检定研究院，批号：111640⁃201707）；没食子酸（中国食品药品检定研究院，批号：110831⁃201605）；5⁃羟甲基糠醛（中国食品药品检定研究院，批号：110998⁃201608）；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯。

1.3 样品

17批山茱萸药材分别从河南、陕西、浙江、安徽等不同产地购得，经国药集团广东环球制药有限公司按《中国药典》2015年版检验均合格，将检验合格的17批药材严格按照《中国药典》2015年版一部酒萸肉饮片项下规定炮制成酒萸肉饮片。17批山茱萸生品、炮制品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性

色谱柱：CORTECS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.6μm）；以乙腈为流动相A，0.2%磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱（0～3 min，2%→8%A；3～9 min，8%→15%A；9～13 min，15%→25%A；13～16 min，25%→100%A；16～19 min，100%A；19.1～23 min，2%A）；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；检测波长：260 nm；进样量：1μL；理论塔板数按马钱苷峰计算应不低于10 000。

表1 17批山茱萸生品、炮制品样品信息Table 1 The Information about 17 batches of Cornusofficinalis Sieb.et Zucc of hygiene and processed products

2.2 对照品溶液的制备

取莫诺苷对照品和马钱苷对照品适量，精密称定，分别加80%甲醇（体积分数，下同）制成每1 mL各含50μg的混合溶液。取没食子酸对照品适量，精密称定，加入70%甲醇（体积分数，下同）制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。取5⁃羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加入70%甲醇制成每1 mL各含0.1 mg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇（体积分数，下同）20 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，滤过，弃去初滤液，取续滤液即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 精密称取山茱萸生品和山茱萸炮制品各1份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，与空白溶剂按“2.1”项色谱条件进样测定，色谱图见图1。可见，空白溶剂对测定无干扰。

2.4.2 精密度试验 精密称取山茱萸生品1份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，以峰4（马钱苷）为参照峰，以共有峰的相对保留时间和相对峰面积为指标计算RSD值，结果均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 精密称取山茱萸生品1份,按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h进样检测，以峰4（马钱苷）为参照峰，以共有峰的相对保留时间和相对峰面积计算RSD值，结果均小于1.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

A.空白溶剂;B.山茱萸药材;C.酒萸肉饮片。图1专属性考察色谱图Figure 1 The chromatograms of specificity

2.4.4 重复性试验 精密平行称取山茱萸生品6份，按“2.3”项的方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，以峰4（马钱苷）为参照峰，以共有峰的相对保留时间和相对峰面积计算RSD值，结果均小于2.0%，表明方法重复性良好。

2.5 山茱萸生品特征图谱共有模式建立及分析

2.5.1 特征图谱的建立 吸取“2.2”项对照品溶液和“2.3”项供试品溶液各1μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图2。经与对照品进行比较，确认峰1为没食子酸，峰2为5⁃羟甲基糠醛，峰3为莫诺苷，峰4为马钱苷。

2.5.2 山茱萸生品特征图谱共有模式建立 取“1.3”项17批不同来源的山茱萸生品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，再按“2.1”项色谱条件进行测定，将实验数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，设定S1为参照图谱，将各色谱峰匹配，建立特征图谱，分析17批样品的图谱，选择5个峰面积稳定且分离度好的色谱峰，确定其为共有指纹峰，17批山茱萸生品UPLC特征图谱共有模式图见图3。

2.6 山茱萸炮制品特征图谱共有模式建立

取“1.3”项下的17批不同来源的山茱萸炮制品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，再按“2.1”项色谱条件进行测定，将实验数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，设定S1为参照图谱，将各色谱峰匹配，建立特征图谱，分析17批样品的图谱，选择5个峰面积稳定且分离度好的色谱峰，确定其为共有峰，17批山茱萸炮制品UPLC特征图谱叠加图谱见图4。17批山茱萸生品、炮制品的对照图谱比较图见图5。

图2 对照品及山茱萸生品色谱图Figure 2 The chromatograms of control substance and Cornus officinalis Sieb.et Zucc of hygiene products

图3 17批山茱萸生品特征图谱共有模式Figure 3 The common pattern of 17 batches of Cornus offici⁃nalis Sieb.et Zucc of hygiene products

2.7 山茱萸炮制前后相似度分析

将17批山茱萸生品和炮制品图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以山茱萸生品图谱为参照图谱，进行峰匹配，计算得到山茱萸生品和炮制品图谱之间的相似度；同时以峰4（马钱苷）为S峰，计算峰2（5⁃羟甲基糠醛）的相对峰面积，结果见表2。可见，17批山茱萸炮制品与生品的相似度结果在0.754～0.994之间，表明山茱萸炮制前后色谱峰的构成具有较高的相似性，用相似度无法区分山茱萸生品和炮制品；同时计算生品和炮制品峰2的相对峰面积；结果17批山茱萸生品峰2的相对峰面积在0.044～0.122之间，而炮制品峰2的相对峰面积在0.284～3.302之间，两者有明显的差异，表明山茱萸炮制后5⁃羟甲基糠醛（峰2）较生品明显增大，可通过峰2的相对峰面积比值加以区分生品与炮制品。

图4 17批山茱萸炮制品特征图谱共有模式Figure 4 The common pattern of 17 batches of Cornus officinalis Sieb.et Zucc of processed products

图5 山茱萸生品、炮制品对照特征图谱Figure 5 The control chromatograms of Cornus officinalis Sieb.et Zucc of hygiene and processed products

3讨论

考察了检测波长（210、240、260 nm）、流动相系统（乙腈⁃0.2%磷酸、乙腈⁃0.1%磷酸、乙腈⁃0.1%甲酸溶液、乙腈⁃0.1%乙酸）及柱温（30、35、40℃）的分离效果，结果以检测波长为260 nm、流动相系统为乙腈⁃0.2%磷酸及柱温为35℃时的分离效果较好。比较提取溶剂（水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇）、提取方式（超声提取、回流提取）及提取时间（30、45、60 min）的提取效果，结果以提取溶剂为50%甲醇、提取方式为超声提取及提取时间为30 min时的提取效果较好。

表2 山茱萸炮制前后相似度和相对峰面积结果Table 2 Similarity and Relative peak area of Cornusofficinalis Sieb.et Zucc of processed products and hygiene products

中药材在炮制过程可提高或降低药材中化学成分的含量，甚至可使某些化学成分消失或产生新物质，本研究的山茱萸药材经过炮制后化学成分的含量发生变化，其中5⁃羟甲基糠醛含量大幅度增加，呈10倍增加趋势，说明炮制程度越强其含量变化越大，可用于区分山茱萸生品和炮制品，也可用于指导山茱萸药材的炮制。本文结果为山茱萸炮制品的质量标准制定、品质评价提供了一定的科学依据，也为山茱萸生品和炮制品的质量控制提供了参考方法。