合欢花药材特征图谱研究及超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱定性分析

张 玉，顾芹英，翟燕娟，李 松，张云天

(江阴天江药业有限公司研究院，江苏 江阴 214434)

合欢花为豆科植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花絮或花蕾，我国的合欢花资源较为丰富，主产于河北省、河南省、陕西省、浙江省和江苏省等地；合欢花性平，味甘，归心、脾经，具有解郁安神之功效。文献报道[1-3]，其所含化学成分种类广泛，包括黄酮类、三萜及其皂苷类、生物碱类、有机酸、甾醇、木脂素和单宁类，其中对黄酮类和三萜及其皂苷类的研究最为广泛。目前，缺乏有关合欢花药材超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)特征图谱和UPLC串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-tandem quadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS)物质基础方面的研究[4]。现代研究结果表明，合欢花水煎液可改善抑郁模型小鼠的抑郁症状，可提高抑郁小鼠学习记忆能力，其所含的黄酮类物质可能是其发挥抗抑郁作用的物质基础，此外还有镇静催眠、抑菌、抗肥胖及调节脑内单胺类神经递质等作用[5-6]。

目前，UPLC-Q/TOF-MS技术已成为复杂基质中多成分的有效、快速、准确的检测手段，相对于传统的高效液相色谱法，UPLC的分离效果更好，分析速度更快，而Q/TOF分辨率高、灵敏度高，能够实现分子量的精确测定，非常适合复杂基质中组分的检测定性[7-8]。查阅相关资料，暂时缺乏有关合欢花中化学成分的液质联用技术研究。本研究开展了合欢花药材UPLC特征图谱研究并借助UPLC-Q/TOF-MS技术定性分析了合欢花药材中的化学成分，该操作简便、快速、准确，可为后续合欢花的质量控制、药效物质基础和体内药动学研究奠定基础和提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC型超高效液相色谱仪(Waters公司)；Empower 3工作站(Waters公司)；安捷伦1290型超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；安捷伦6530四级杆串联飞行时间质谱仪，配有标准电喷雾离子源(美国安捷伦公司)；MassHunter Data Acquisition采集工作站，MassHunter Qualiative Analysis分析工作站(美国安捷伦公司)；十万分之一型和百万分之一型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；KQ-250B型超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；纯水系统(Sartorius公司)；AS165 W型离心机[亚速旺(上海)商贸有限公司]。

1.2 药品与试剂

乙腈(色谱纯，Thermo Fisher公司)；水为屈臣氏蒸馏水；磷酸(色谱纯，Aladdin公司)；甲酸(色谱级，Sigma公司)；金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品及槲皮苷对照品购自中国食品药品检定研究院，编号分别为111521-201406、111809-201403及180109-02AB；L-色氨酸对照品、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷对照品购自上海诗丹德生物技术有限公司，编号分别为6135、6455。合欢花药材由江阴天江药业有限公司提供，经江阴天江药业有限公司研究院唐波研究员鉴定为豆科植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花絮或花蕾。

2 方法与结果

2.1 特征图谱

2.1.1 色谱条件：色谱柱为CORTECS UPLC T3柱(Waters, 2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，以0.1%甲酸-水为流动相A、以乙腈为流动相B，柱温为35 ℃，流速为0.30 ml/min，检测波长为220 nm，进样量为1 μl。梯度洗脱条件如下：0～4 min(92%→85%A)，4～7 min(85%→77%A)，7～10 min(77%→74%A)，10～14 min(74%→40%A)，14～16 min(40%A)，16～16.1 min(40%→92%A)。

2.1.2 溶液的制备：(1)对照品溶液制备。取槲皮苷对照品适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 ml含槲皮苷50 μg的溶液，即得。取L-色氨酸对照品适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，加水制成含10 μg/ml的溶液，即得。分别取金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷对照品适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，加70%甲醇分别制成含100、20和70 μg/ml的溶液，即得。(2)供试品溶液制备。取本品中粉约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，称定质量，超声30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 方法学考察：(1)精密度。取同一批号样品，按“2.1.2(2)”项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，连续进样6次，1次1 μl，以槲皮苷所对应的峰为参照峰(S峰)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.29%～1.13%，各共有峰的相对峰面积的RSD为0.03%～0.14%，RSD均<2.0%，表明仪器精密度良好。(2)稳定性。取同一批号样品，按“2.1.2(2)”项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，每隔2 h进样1次，1次1 μl，共测定12 h，以槲皮苷所对应的峰为参照峰(S峰)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.04%～1.05%，各共有峰的相对峰面积的RSD为0.42%～1.54%，RSD均<2.0%，表明供试品溶液12 h内稳定性良好。(3)重复性。取同一批号样品，按“2.1.2(2)”项下供试品溶液制备方法分别制成6份供试品溶液，各进样1次，1次1 μl，以槲皮苷所对应的峰为参照峰(S峰)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.20%～1.05%，各共有峰的相对峰面积的RSD为0.05%～1.28%，RSD均<2.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.4 特征图谱建立和共有峰指认：(1)特征图谱建立。取17批各个产地合欢花药材适量，分别按照“2.1.2(2)”项下制成供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》进行分析、比较，经多点校正和自动匹配后，生成对照特征图谱，以槲皮苷为参照峰(S峰)，共标定5个共有峰，建立合欢花药材UPLC特征图谱。其他4个峰的相对保留时间分别为0.38、0.87、0.89及1.14，各共有峰的相对保留时间RSD为0.06%～1.73%，RSD均<2.0%，见图1。(2)各共有峰的指认。取各对照品溶液、合欢花药材适量，按照“2.1.2(2)”项下制成供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析，结果峰1、峰2、峰3、峰4及峰5分别为L-色氨酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷及山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷，见图2。

2.2 液质联用定性分析

2.2.1 色谱条件：色谱柱为CORTECS UPLC T3柱(Waters, 2.1 mm×100 mm,1.6 μm)，以0.1%甲酸-水为流动相A、以乙腈为流动相B，柱温为35 ℃，流速为每0.30 ml/min，进样量为2 μl。梯度洗脱条件如下：0～4 min(92%→85%A)，4～7 min(85%→77%A)，7～10 min(77%→74%A)，10～14 min(74%→40%A)，14～16 min(40%A)，16～16.1 min(40%→92%A)。

2.2.2 质谱条件：离子源为双喷ESI离子源，干燥气温度300 ℃，流量8 L/min，雾化器压力 35 psi；负离子模式下毛细管电压3 500 V，正离子模式下毛细管电压4 000 V，毛细管出口电压120 V，锥孔电压65 V，碰撞能量10 eV；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比采集范围m/z 100～3 000，采样速度1 spectra/s，采样时间1 000 ms/spectra；负离子采用TFANH4(112.985 587)和HP-0921(1 033.988 109)进行质量数实时校准，正离子采用嘌呤(121.050 873)和HP-0921(922.009 798)进行质量数实时校准，雾化压力5 psi。

图1 合欢花药材UPLC特征图谱

A.L-色氨酸；B.金丝桃苷；C.异槲皮苷；D.槲皮苷；E.山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷；F.合欢花药材；G.空白对照A.L-tryptophan; B.hyperin; C.isoquercitrin; D.quercetin; E.kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside; F.albizia flower; G.blank control

2.2.3 合欢花中化学成分数据库的建立：根据国内外文献有关合欢花中化学成分的研究报道，收集和整理合欢花中30个化学成分，采用安捷伦“formula-database generator”软件，计算精确相对分子量，建立包括化合物名称、分子式、分子量和CAS号等在内的目标成分数据库。

2.2.4 样品的总离子流图(TIC)：采用“2.2.1”“2.2.2”和“2.2.3”项下的优化条件，采集正负离子模式下的图谱，结果见图3。

A.样品ESI+；B.样品ESI-A. ESI+ sample; B. ESI- sample

2.2.5 化合物的鉴别过程：以峰11槲皮苷、峰14山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷为例，说明合欢花中色谱峰的鉴别过程。峰11的保留时间为9.73 min，m/z 449.108 7[M+H]+为其准分子离子峰，利用Qualitative Analysis数据分析软件的calculator功能计算精确质量数的可能元素组成，设定误差<5 ppm，并比对已建立的数据库中已知化合物的质荷比，确定元素组成为C21H20O11。计算C21H20O11的同位素分布情况，与实际情况相比对，同位素分布的理论值与实际值吻合良好，结合文献[9]推测该峰为槲皮苷，主要的二级特征性的碎片离子m/z 303.050 9为结构中苷键断裂丢失1个鼠李糖基(C6H10O4)而形成，见图4。同理，依照上述鉴别过程，峰14的最终确定的元素组成均为C20H20O10，结合文献[10]报道推测为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷，主要的二级特征性的碎片离子m/z 287.055 6为结构中苷键断裂丢失1个鼠李糖基(C6H10O4)而形成，见图5。

A.峰11的精确质量及同位素图；B.峰11的碎片质谱图；C.峰11可能的裂解图示A. accurate mass and isotopic map of peak 11; B.fragment mass spectrum of peak 11; C.possible splitting decomposition graph of peak 11

2.2.6 鉴别结果：依据Q-TOF-MS测得的高分辨的精确分子量，比对所建的数据库，借助Qualiative Analysis离线分析软件计算分子式，将理论值与实际值比对，结合相关参考文献，共鉴定出17个化合物，其中游离氨基酸类2个，有机酸类1个，黄酮及苷类12个，三萜皂苷类1个，见表1。

3 讨论

特征图谱实验考察了水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、30%乙醇及稀乙醇等不同的提取溶剂，水提液的色谱峰较少，结合各提取溶剂的特区峰形和提取效率，选择70%甲醇作为提取溶剂。考察了超声提取、加热回流和振摇提取三种不同的提取方式，结果表明，提取方式的不同对合欢花的影响不大，采用超声处理时，合欢花的提取率微高于其他提取方式，综合考虑，采用超声处理作为最终的提取方式。同时考察了15、30、45和60 min四个不同提取时间，结果表明，各提取时间所得色谱峰的数目一致，超声提取15、30 min的提取率较高，为保证提取充分，最终选择超声提取时间为30 min。对于流动相体系，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸及乙腈-0.1%醋酸系统，发现乙腈-水系统基线漂移严重、色谱峰数目少，乙腈-0.1%磷酸体系基线平稳、峰数目和容量高，故选取乙腈-0.1%磷酸为流动相。

A.峰14的精确质量及同位素图；B.峰14的碎片质谱图；C.峰14可能的裂解图示A.accurate mass and isotopic map of peak 14; B.fragment mass spectra of peak 14; C.possible splitting decomposition graph of peak 14

表1 合欢花药材UPLC-Q-TOF/MS技术分析结果

液质联用定性分析实验考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇及水作为不同的提取溶剂，结果表明，70%甲醇提取色谱峰容量高于其他提取溶剂。考察了超声提取、加热水浴回流提取两种方法，结果表明，超声提取简单易操作，且提取效率略高于水浴回流。同时，考察了15、30、45和60 min四个不同提取时间，结果表明，30 min提取时间的峰强度和峰容量优于其他提取时间。对于流动相体系，考察了乙腈-水、甲醇-水及乙腈-0.1%甲酸系统，发现甲醇-水系统基线漂移严重，干扰大，加了0.1%甲酸的乙腈-水体系后，峰强度明显提高，峰数目和容量高于乙腈-水体系，故选取乙腈-0.1%甲酸为流动相。对于质谱条件中的碰撞能量(CE)，考察了10、15和25 eV三种不同的能量，结果显示，10 eV下能够明显得观察准分子离子峰，符合电喷雾这类软电离质谱的温和的碰撞效果，大多数化合物在正离子模式下有较好的响应，故实验选取正离子模式进行最大限度的获取质谱信息。

合欢花在镇静催眠、抗抑郁、抗菌等方面有独特的药理活性[16-19]，相关的药材质量控制研究主要针对槲皮苷、异槲皮苷等1～3种黄酮类物质进行含量测定[13]。我国合欢花资源较为丰富，单一的指标成分不能很好地控制药材质量，且有关合欢花全成分的物质基础研究较少，因此，有必要丰富药材的质量控制手段，对其成分进行系统研究。本研究建立了合欢花药材UPLC特征图谱来控制整体质量，方法学验证了精密度、重复性和稳定性等；并运用UPLC-Q/TOF-MS技术对合欢花药材进行快速分析，共鉴定出17个化合物，其中游离氨基酸类2个，有机酸类1个，黄酮及苷类12个，三萜皂苷类1个。该方法快速、灵敏、准确，可大大缩短天然产物成分分析的研究周期，节约成本，可作为合欢花质量控制的方法之一，同时为合理开发合欢花奠定了一定的基础。