漆籽油纳米乳液的制备及其抗氧化、防紫外辐射活性研究

周 昊，薛兴颖，陈虹霞，叶建中，王成章

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042)

漆籽是我国重要经济林树种漆树(Toxicodendronvernicifluum)的种子[1]。漆籽油是从漆籽种仁中提取的油脂，为黄色透明状的液体油脂，具有特有的香气。漆籽油是一种富含不饱和脂肪酸的功能性油脂，其含亚油酸≥63%，含油酸≥23%[2-3]，具有调节血脂、消炎止痛、降低胆固醇、延缓衰老等保健功能和护肤功效，其在功能食品和化妆品领域具有很好的应用前景[4-5]。然而由于漆籽油中不饱和脂肪酸含量极高，在贮藏加工过程中极易被氧化，且水溶性差、生物利用率低等特点，限制了其产品开发与应用。近年来，纳米乳液作为一种简单有效的制剂，已被广泛应用于功能性油脂的包埋与传递，能够防止油脂的功能营养成分被氧化，并提高其水溶性和生物利用率[6-7]。纳米乳液平均粒径在50～500 nm，是由水相、油相、表面活性剂及助表面活性剂等按照一定比例混合所形成的热力学稳定的胶体分散体系。纳米乳液的制备方法包括高能乳化法和低能乳化法，其中高压均质乳化技术是最常用的一种制备纳米乳液的高能乳化法，高压均质法具有乳化时间短、乳液粒径小、体系稳定、表面活性剂的用量少等优势[8-10]。目前，已有文献报道通过高压均质乳化技术制备乳木果油、沙棘果油、紫苏籽油、核桃油等纳米乳液，但是还未见通过高压均质乳化法制备漆籽油纳米乳液的相关报道[11-13]。本研究采用高压均质法制备漆籽油纳米乳液，考察压力、均质次数、乳化剂用量及油添加量等参数对纳米乳液平均粒径及 Zeta电位的影响，优化纳米乳液制备工艺条件，并对制得的漆籽油纳米乳液特性及稳定性、抗氧化和抗紫外辐射活性进行研究，以期为漆籽油日化产品及保健品开发应用提供理论基础。

1 实 验

1.1 材料与试剂

漆籽油，购于陕西秦乔农林生物科技有限公司；酪蛋白酸钠、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、VC、二甲基亚砜(DMSO)，购于阿拉丁试剂上海有限公司；改良伊格尔(DMEM)液体培养基、四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液，购于南京诺尔曼生物技术有限公司；小鼠成纤维细胞 NIH 3T3，购于中国医学科学院细胞中心；其他试剂均为分析纯。

1.2 漆籽油纳米乳液的制备

以酪蛋白酸钠为乳化剂，取一定量的乳化剂溶解于去离子水中，磁力搅拌器室温下搅拌过夜，作为水相，漆籽油为油相，将油相与水相溶液按质量比6 ∶100混合均一，用高速分散机在20 000 r/min 下剪切5 min，形成粗乳液。然后将粗乳液用高压均质机进行均质，在一定均质压力和均质次数条件下，制备得到漆籽油纳米乳液。

制备过程中分别以乳化剂质量分数、漆籽油质量分数、均质压力、均质次数为考察因素进行单因素试验，测定不同条件下制备的漆籽油纳米乳液的平均粒径和Zeta电位。

1.3 漆籽油纳米乳液的表征

1.3.1稳定性考察 将制备的漆籽油纳米乳液分别于4，25和60 ℃条件下放置30 d，每5 d测定1次乳液的平均粒径和Zeta电位值。

1.3.2平均粒径、PDI及Zeta电位的测定 取适量的待测纳米乳液用去离子水稀释1 000倍后，摇晃均匀，用英国Malvern公司ZS90型纳米粒度及Zeta电位分析仪，分别测定制备的漆籽油纳米乳液的平均粒径、多分散指数(PDI)及Zeta电位。

1.4 漆籽油纳米乳液的抗氧化活性

1.4.1DPPH 自由基(DPPH·)清除能力 配制质量浓度分别为5、10、20、40、60、80和100 mg/L的漆籽油纳米乳液，精密吸取0.2 mL的漆籽油纳米乳液与4 mL的0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液混合均匀，于暗处反应30 min后，在517 nm下测吸光度A1。空白实验组以0.2 mL乙醇溶液代替漆籽油纳米乳液，其他操作不变，所得吸光度为A2；阳性对照组以0.2 mL系列浓度的VC溶液替代漆籽油纳米乳液，其他操作不变。计算样品对DPPH·的清除能力，清除率=(1-A1/A2)×100%，并求出有效中浓度(EC50)。

1.4.2ABTS 自由基(ABTS+)清除能力 取7 mmol/L ABTS 溶液5 mL与88 μL 的140 mmol/L过硫酸钾溶液混合，室温、避光静置，15 h后用超纯水稀释至溶液在734 nm波长下吸光度约为0.7，所得溶液即为ABTS+溶液。配制质量浓度分别为5、10、20、40、60、80和100 mg/L的漆籽油纳米乳液，精密吸取0.2 mL的漆籽油纳米乳液与2 mL配制好的ABTS+溶液混合均匀，避光反应10 min后，在734 nm下测吸光度A′1。空白实验组以0.2 mL乙醇溶液代替漆籽油纳米乳液，其他操作不变，所得吸光度为A′2；阳性对照组以0.2 mL系列浓度的VC溶液替代漆籽油纳米乳液，其他操作不变。计算样品对ABTS+的清除能力，清除率=(1-A′1/A′2)×100%，并求出EC50。

1.4.3羟基自由基(OH·)清除能力 配制质量浓度分别为5、10、20、40、60、80和100 mg/L的漆籽油纳米乳液。在10 mL比色管中分别加入1.0 mL的漆籽油纳米乳液，1.0 mL浓度为 2 mmol/L的水杨酸乙醇溶液，1.2 mL浓度为 1.0 mmol/L的FeSO4溶液以及1.0 mL浓度为2.0 mmol/L的H2O2溶液，反应0.5 h后，在580 nm测其吸光值A″1。空白实验组以1.0 mL蒸馏水代替漆籽油纳米乳液，其他操作不变，所得吸光度为A″2；阳性对照组以1.0 mL系列浓度的VC溶液替代漆籽油纳米乳液，其他操作不变。不加H2O2时580 nm处的吸光值为A″3。计算样品对OH·的清除能力，清除率=[1-(A″1-A″3)/A″2]×100%,并求出EC50。

1.5 漆籽油纳米乳液的抗紫外辐射活性

1.5.1对NIH 3T3细胞生长的影响 将小鼠成纤维细胞 NIH 3T3 以6 000个/孔接种至96孔细胞培养板中，置于体积分数为5%的CO2培养箱中在37 ℃下培养24 h，弃去上清液，用DMEM培养基配制质量浓度为20 mg/L的漆籽油纳米乳液，然后再用DMEM培养基进行逐级稀释成系列质量浓度的漆籽油纳米乳液(10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/L)，分别加入培养板中，对照组加入DMEM培养基，每孔100 μL，孵育24 h后，采用MTT法进行检测。

1.5.2UVA辐射NIH 3T3细胞损伤模型 将NIH 3T3细胞分为6组：正常细胞对照组和5个UVA损伤组。用DMEM培养基将NIH 3T3细胞培养至融合度 70%～80%，置于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，每组4个复孔，孵育24 h后，各UVA 损伤组进行紫外辐照处理，细胞距辐照光源15 cm，辐照强度5.4 W/m2，辐照时间分别为15、20、30、60和120 min，继续培养24 h后，采用MTT法进行检测。

1.5.3体外抗UVA辐射实验 将细胞随机分为3组：细胞对照组、UVA损伤组、UVA损伤+漆籽油纳米乳液组。将NIH 3T3细胞接种至96孔细胞培养板中(6 000个/孔)，置于体积分数为5%的CO2培养箱中在37 ℃下培养24 h，先将UVA损伤组、UVA损伤+漆籽油纳米乳液组按损伤模型结果接受UVA 辐射，然后UVA损伤+漆籽油纳米乳液组分别加入系列质量浓度(10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/L)的漆籽油纳米乳液，细胞对照组和UVA损伤组则加入DMEM培养基，孵育24 h后，采用MTT法进行检测。

1.5.4MTT法检测 参照文献[16]，在细胞培养板每孔加入20 μL的质量浓度为5 g/L的MTT溶液，继续培养4 h后，弃去上清液，加入100 μL/孔的DMSO，避光振荡15 min，酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为570 nm时的吸光值，计算细胞存活率。细胞存活率=实验吸光值÷空白对照吸光值×100%。

2 结果与讨论

2.1 漆籽油纳米乳液的制备工艺优化

2.1.1乳化剂用量 分别配制质量分数为1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%的酪蛋白酸钠水溶液，室温下搅拌过夜，然后缓慢加入水相质量6%的漆籽油，用高速分散机按1.2节条件进行制备，均质压力选择100 MPa，均质4次得漆籽油纳米乳液。乳液的平均粒径及Zeta电位绝对值见图1(a)。

a.乳化剂质量分数mass fraction of emulsifier；b.漆籽油质量分数mass fraction of lacquer oil；c.均质压力homogeneous pressure；d.均质次数number of homogen图1 不同工艺条件下乳液的平均粒径及Zeta电位绝对值Fig.1 Average particle size and Zeta potential absolute value of nanoemulsion under different process condition

由图可知，随着乳化剂用量的增加，漆籽油纳米乳液的平均粒径先减小后增大，Zeta电位绝对值先逐渐升高后又降低。当乳化剂质量分数为2.5%时，乳液具有最小的平均粒径为162.5 nm，最大的Zeta电位绝对值为40.36 mV，此时乳液的稳定性最好。随着乳化剂用量增加，它可以包裹更多的油滴，降低表面张力，减小乳化时能量的消耗，提高乳化效率，从而使平均粒径减小；但是当乳化剂用量进一步增加时，纳米乳液的平均粒径反而增大，因为体系中没有足够的油滴被乳化剂吸附，多余的乳化剂部分以胶束的形式存在于体系中，使得乳液微粒发生聚合现象，粒径增大，稳定性也会降低[10-11]。因此，选择乳化剂质量分数为2.5%。

2.1.2漆籽油质量分数 配制质量分数为2.5%的酪蛋白酸钠水溶液，室温下搅拌过夜，然后分别缓慢加入质量分数2%、4%、6%、8%、10%和12%的漆籽油，用高速分散机按1.2节条件进行制备，均质压力选择100 MPa，均质4次得漆籽油纳米乳液。乳液的平均粒径及Zeta电位绝对值见图1(b)。由图可知，随着漆籽油质量分数的增加，漆籽油纳米乳液的粒径呈现先下降后上升的趋势，Zeta电位绝对值呈现先上升后下降的趋势。油脂含量在一定范围内，乳化剂可较好地乳化所加入的油脂，形成稳定的纳米乳液，而当油脂加入量过大时，相同乳化剂为了乳化更多的油脂，则需要増大所乳化的油滴体积，降低油滴与水相的接触面积，导致体系粒径的增大，稳定性也变差，因此油脂含量过大不利于形成粒径小且稳定的纳米乳液[12-13]。漆籽油质量分数为6%时，乳液的粒径最小，Zeta电位绝对值最大，乳液最稳定，因此最佳的漆籽油添加量为6%。

2.1.3均质压力 配制质量分数为2.5%的酪蛋白酸钠水溶液，室温下搅拌过夜，然后缓慢加入6%的漆籽油，用高速分散机按1.2节条件进行制备，设定均质压力分别为60、80、100、120和140 MPa，均质4次得漆籽油纳米乳液。乳液的平均粒径及Zeta电位绝对值见图1(c)。由图可知，随着均质压力的增加，漆籽油纳米乳液的粒径呈现先下降后上升的趋势，Zeta电位绝对值呈现先上升后下降的趋势。高压均质过程中，乳液分散相颗粒在巨大剪切、撞击空穴效应的作用下，逐渐形成纳米乳滴。随着均质压力的增加，机械力输出强度增大，颗粒粒径变小。当均质压力高于100 MPa时，此时机械输出作用过强，分散相粒径的比表面积急剧增加，有限的乳化剂不能被有效吸附到所有液滴表面上，乳化作用下降，液滴相互聚集，粒径会变大，乳液体系也会变得不稳定[14-15]。均质压力为100 MPa时，乳液的粒径最小，Zeta电位绝对值最大，乳液最稳定，因此最佳的均质压力为100 MPa。

2.1.4均质次数 配制质量分数为2.5%的酪蛋白酸钠水溶液，室温下搅拌过夜，然后缓慢加入6%的漆籽油，用高速分散机按1.2节条件进行制备，均质压力选择100 MPa，设定均质次数分别为1、2、3、4、5和6次，制得不同的漆籽油纳米乳液。不同均质次数条件下乳液的平均粒径及Zeta电位绝对值见图1(d)。由图可知，随着均质次数的增加，漆籽油纳米乳液的粒径呈现下降趋势，Zeta电位绝对值呈现上升趋势。但是当均质次数超过4次时，乳液粒径和Zeta电位绝对值变化不大。高压均质过程中，在一定均质压力下，随着均质次数的增加，乳液粒径大小会下降，随着均质循环次数的增加，其机械作用时间变长，之前未被均质细化的大颗粒或小颗粒聚集体在多次均质后粒径减小，乳液乳滴也更加稳定[15]。在实际应用中，均质次数的选择对节约成本、减少机器工作时间有重要作用，综合考虑，选择均质次数为4次。

2.1.5验证实验 通过单因素试验，确定漆籽油纳米乳液的较佳工艺条件为：乳化剂质量分数2.5%，漆籽油质量分数6%，均质压力为100 MPa，均质次数4次。按此工艺条件制备 3 批漆籽油纳米乳液，测定平均粒径分别为162.5、165.3和161.2 nm，平均值为163.0 nm；PDI分别为0.215、0.228和0.232，平均值为0.225；Zeta电位分别为-40.36、-41.39和-41.28 mV，平均值为-41.01 mV；由数据可知，漆籽油纳米乳液分布均一，说明该制备方法可行，工艺的重复性良好。

2.2 漆籽油纳米乳液的稳定性

乳液在运输贮藏过程中，温度对其理化稳定性具有显著影响[6]。温度升高会引起纳米乳液体系内的粒子受热吸收能量，迁移活动加剧，布朗运动增强，进而引起乳液的破乳或液滴聚合等现象。因此，如何使乳液在保质期内保持良好的物理稳定性是其应用于食品、化妆品等领域的重要问题。将漆籽油纳米乳液在 4、25和60 ℃条件下贮藏 30 d，结果如表1所示。

表1 不同温度贮藏过程中漆籽油纳米乳液的稳定性Table 1 The stability of lacquer seed oil during different temperature storage

在4和25 ℃贮藏温度下，30 d内漆籽油纳米乳液平均粒径和 Zeta电位值变化较小。在4 ℃贮藏30 d后，乳液的平均粒径由162.3 nm增加到 180.6 nm，增长率为11.3%；在25 ℃贮藏30 d后，漆籽油纳米乳液的平均粒径由162.3 nm增加到182.4 nm，增长率为12.4%；而在60 ℃时，乳液的平均粒径增长较大，由162.3 nm增加到206.8 nm，增长率为27.4%。这是因为较高的环境温度破坏了纳米乳液内部结构，分子运动速率增加，粒子相互碰撞聚集，导致粒径变大。然而漆籽油纳米乳液在4、25和60 ℃条件下贮藏30 d，平均粒径仍能保持在200 nm级的液滴范围内且未出现破乳或相分离现象，同时漆籽油纳米乳液的Zeta电位均处于-41～-39 mV，维持在乳液稳定的范围内，表明漆籽油纳米乳液在长期贮藏过程中具有良好的物理稳定性。

2.3 漆籽油纳米乳液的抗氧化活性

漆籽油纳米乳液对DPPH、ABTS及羟基自由基的清除能力如图2所示，可以看出漆籽油纳米乳液对3种自由基均具有很好的清除作用，清除率随着质量浓度的增加而变高。有效中浓度(EC50)是指自由基被清除50%时所需要的抗氧化剂的质量浓度，常用来表征抗氧化能力的大小，EC50越小，抗氧化剂的抗氧化效果越强。漆籽油纳米乳液对DPPH、ABTS及羟基自由基的EC50分别为24.26、23.77和21.10 mg/L，而漆籽油对DPPH、ABTS及羟基自由基的EC50分别为35.38、41.29和38.52 mg/L，说明漆籽油制备成纳米乳液后可显著增强抗氧化活性。同时本试验也采用VC为阳性对照，VC对DPPH、ABTS及羟基自由基的EC50分别为38.48、43.25和40.56 mg/L。通过比较看出，漆籽油纳米乳液对3种自由基的清除率明显高于VC(P<0.05)，表明漆籽油纳米乳液具有比VC更好的抗氧化活性。

a.DPPH·;b.ABTS+;c.OH·图2 不同质量浓度的漆籽油纳米乳液和VC的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of lacquer seed oil nanoemulsion and VC at different concentrations

2.4 漆籽油纳米乳液的抗紫外辐射活性

将NIH 3T3正常细胞对照组的相对细胞存活率设定为 100%，漆籽油纳米乳液对NIH3T3细胞生长的作用见表2。由表2数据可知，与正常细胞对比，漆籽油纳米乳液对 NIH 3T3细胞无明显的细胞毒性，NIH 3T3细胞的存活率随着漆籽油纳米乳液浓度的增加而升高，表明漆籽油纳米乳液对 NIH 3T3细胞有促增殖的作用。NIH 3T3细胞在接受不同时间 UVA 辐照后，细胞均受到不同程度的损伤，随着辐照时间的延长，细胞损伤的程度越高。UVA 不同辐照时间对NIH 3T3细胞的损伤较大，在15、20、30、60和120 min的辐射时间下，细胞存活率分别为(92.6±1.5)%、(79.5±1.3)%、(58.2±1.2)%、(6.5±0.3%)和(0.0±0.0)%。由此可知，当UVA 辐照时间在30 min时，细胞死亡率处在半数死亡值左右，是建模的理想剂量，因此后续UVA损伤建模实验选择30 min的辐照时间。漆籽油纳米乳液对UVA辐射损伤NIH 3T3的修复作用结果亦见表2，表中数据表明漆籽油纳米乳液对UVA损伤的NIH 3T3细胞有显著的修复作用，当漆籽油纳米乳液质量浓度大于等于5 mg/L时对UVA损伤的NIH 3T3细胞修复作用更明显，细胞的存活率可高于正常NIH 3T3细胞的存活率(P<0.05)。因此漆籽油纳米乳液具有很好的抗紫外辐射活性。

表2 漆籽油纳米乳液的抗紫外辐射活性Table 2 Anti-UV radiation activity of lacquer seed oil nanoemulsion

3 结 论

3.1以漆籽油为原料，酪蛋白酸钠为乳化剂，以高压均质法制备了漆籽油纳米乳液，采用单因素试验对制备条件进行了优化，得到较佳工艺条件为：乳化剂质量分数2.5%，漆籽油质量分数6%，均质压力100 MPa，均质次数4次。优化条件下制备的漆籽油纳米乳液平均粒径为163.0 nm，Zeta电位为-41.01 mV，PDI为0.225；乳液的贮藏稳定性很好，在4、25和60 ℃条件下贮藏 30 d，平均粒径保持在210 nm以内。

3.2漆籽油纳米乳液对DPPH、ABTS及羟基自由基的EC50分别为24.26、23.77和21.10 mg/L，显示出比阳性对照VC更好的抗氧化活性(EC50分别为38.48、43.25和40.56 mg/L)。

3.3漆籽油纳米乳液对NIH 3T3细胞无明显的细胞毒性，对正常NIH 3T3细胞有促增殖的作用。漆籽油纳米乳液对UVA损伤的NIH 3T3细胞有显著的修复作用，在质量浓度大于5 mg/L时，细胞的存活率可高于正常NIH 3T3细胞的存活率。因此漆籽油纳米乳液具有很好的抗紫外辐射活性。