高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法测定植物样品中的4种砷形态

秦玉燕，蓝 唯，蒋越华，王运儒，时鹏涛，吕丽兰，吕玉莲

(广西壮族自治区亚热带作物研究所,农业部农产品质量安全风险评估实验室(南宁),南宁 530001)

砷是一种毒性较强的重金属污染物,是国际癌症研究机构(IARC)最早确认的一类致癌物。摄入过量的砷可导致皮肤、消化、神经、生殖、造血以及免疫等系统不同程度的损伤。砷的毒性与其形态密切相关,无机砷包括砷酸[As(Ⅴ)]和亚砷酸[As(Ⅲ)],毒性均很强,且As(Ⅲ)毒性是As(Ⅴ)的60倍;有机砷如一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)毒性较弱;在海洋生物中分布较多的有机砷如砷胆碱(AsC)、砷甜菜碱(AsB)、砷糖、砷脂等基本无毒。因此,以总砷含量高低来评价食品的安全性并不科学,砷形态的分析对食品安全和环境健康风险评估具有重要意义。

目前,砷形态分析的前处理方式包括热浸提[1]、振荡提取[2]、超声辅助提取[3]和微波辅助提取[4]等。文献[5]在85 ℃下以0.15 mol·L－1硝酸溶液热浸提菟丝子药材1.5 h,得到其中6种砷形态的回收率为91.7%～105%。文献[6]以体积比为1∶1的甲醇-水溶液超声提取饲料样品中的7种砷形态,得到的回收率为76.3%～108%。由于砷形态不稳定,样品前处理过程的关键是在保证样品中砷的原始形态不发生变化的同时获得最大的提取效率。热浸提和振荡提取一般伴随加热,但温度升高可能会引起砷形态的变化;超声辅助提取可将样品颗粒打碎,增加溶剂与颗粒的接触面积,使包裹在颗粒内部的砷溶出;微波辅助提取操作较为复杂,实际应用较少[7]。另外,由于样品中砷形态的差异和基质效应的影响,针对不同基质的样品可能需要采用不同的前处理方法。

测定砷形态最常见的方法是高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)[8-9]和高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLCHG-AFS)[10-11]。HPLC-ICP-MS 具有灵敏度高的特点,近年来在元素形态分析方面发展迅速,但较高的仪器价格和运行费用使其无法在普通实验室普及。HPLC-HG-AFS具有运行成本低、操作简便和灵敏度高等特点,已广泛应用于砷、汞、硒等元素的形态分析[12]。

蔬菜和谷类作物的砷摄入是人类摄取砷的主要途径,其中,水稻、蔬菜(特别是水生蔬菜)等对砷的富集作用较强[13],且其中的砷主要以As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA 等4种砷形态存在[14-15]。因此,本工作以大米、蔬菜等植物性样品为待测对象,通过优化样品前处理方法和仪器工作条件,建立了As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA 等4 种砷形态的HPLC-HG-AFS分析方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

SA-20型原子荧光形态分析仪,配有100μL进样环的自动进样器和933型原子荧光光度计;CNW IC-Guard RP净化小柱(1 mL);ZHSY-50N 型振荡培养箱;KQ-600型超声波清洗器;Molcell 1810a细胞型超纯水器;TGL-20M 型医用离心机;AB204-S型电子天平。

4种砷形态混合标准储备溶液:10 mg·L－1,介质为水。其他所需质量浓度均由此溶液用水稀释制得。

砷酸根标准物质(GBW 08667,17.5μg·g－1,以硒计);亚砷酸根标准物质(GBW 08666,75.7μg·g－1);MMA 标准物 质(GBW 08668,25.1μg·g－1);DMA 标准物 质(GBW 08669,52.9μg·g－1)。大米粉 标准物 质 GBW (E)100356、GBW(E)100351、GBW(E)100348。

其他试剂均为分析纯及以上;玻璃仪器均需在洗涤干净后在25%(体积分数,下同)硝酸溶液中浸泡24 h,用水洗净,晾干,备用。试验用水为一级水(电阻率不小于18.25 MΩ·cm)。

1.2 仪器工作条件

1)HPLC 条件 Hamilton PRP-X100色谱柱(250 mm×4.1 mm,10μm);流动相为25 mmol·L－1磷酸氢二铵-甲酸溶液(pH 6.0),等度洗脱,流量1.0 mL·min－1;进样体积100μL。

2)HG-AFS条件 还原剂为22.5 g·L－1硼氢化钾和5 g·L－1氢氧化钠混合溶液;载流为1.2 mol·L－1盐酸溶 液;负高压300 V;灯电流100 mA;辅助电流50 mA,载气流量500 mL·min－1,屏蔽气流量600 mL·min－1。

1.3 试验方法

称取1.000 g样品于离心管中,加入0.15 mol·L－1硝酸溶液10 mL,超声提取30 min,然后以8 000 r·min－1的转速离心10 min,吸出上清液,重复提取1次,合并上清液,过0.45μm 水系滤膜后用CNW IC-Guard RP小柱净化,按照仪器工作条件测定砷形态。

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析,采用Duncan′s进行多重比较。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

砷形态的常用提取溶剂主要是水、酸溶液和甲醇溶液[16]。试验对比了水、0.15 mol·L－1硝酸溶液和50%(体积分数,下同)甲醇溶液的提取效果。结果发现,水的提取效率最低;0.15 mol·L－1硝酸溶液的提取效率最高;50%甲醇溶液提取的样品中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的峰形变宽,可能是由于样品中残留的少量甲醇引起的峰拖尾。因此试验选择0.15 mol·L－1硝酸溶液为提取溶剂。

基于文献[17-18],以已知总砷含量为0.54 mg·kg－1的莲藕为待测对象,试验比较了70 ℃水浴振荡提取2 h、90 ℃电热板热浸提2 h和超声提取30 min等3种不同提取方式对砷形态的提取效果。计算3种方式下的4种砷形态提取率及含量总和,并对其进行显著性差异分析,结果见表1。同时还进行了2个浓度水平的加标回收试验,结果见表1。其中,测定值、砷形态总和和提取率为平均值±标准偏差(),a,b为差异显著(P＜0.05)标识;砷形态 总和为As(Ⅲ)、DMA、MMA 和As(Ⅴ)质量分数之和;提取率为砷形态总和占总砷含量的百分比。

由表1可知:莲藕中主要的砷形态为As(Ⅲ)和As(Ⅴ);3种提取方式得到的砷提取率为87.7%～96.3%,其中,超声提取的砷提取率最高。差异性分析结果表明,超声提取得到的砷形态总和提取率的结果均显著高于水浴振荡提取和电热板热浸提(P＜0.05);3种提取方式得到的回收率为75.6%～101%,其中,超声提取对As(Ⅴ)、DMA 和MMA等3种砷形态的回收率均高于水浴振荡提取和电热板热浸提的。综合考虑,试验选择的提取方式为超声提取。

表1 不同提取方式的影响Tab.1 Effect of the different extraction methods

试验还发现,提取溶液经CNW IC-Guard RP小柱净化后,可以有效去除样品中的有机物杂质,改善色谱峰峰形和延长色谱柱的使用寿命。因此,试验在对样品进行提取后又增加了CNW IC-Guard RP小柱净化这一步骤。

2.2 色谱分离条件的优化

2.2.1 流动相酸度

以40 mmol·L－1磷酸氢二铵溶液为流动相,用20%(体积分数,下同)甲酸溶液调节其酸度,考察了不同流动相酸度对砷形态分离效果的影响,结果见图1。

图1 4种砷形态的保留时间随流动相酸度变化的曲线Fig.1 Curves showing changes of retention time of 4 arsenic species with the acidity of mobile phase

由图1可知:流动相pH 为4.5～8.0 时,随着pH 增大,As(Ⅲ)的保留时间变化不明显,DMA 和As(Ⅴ)的保留时间缓慢延长,MMA 的保留时间缓慢缩短。流动相pH 为4.5～5.0 时,As(Ⅲ)和DMA 部分重叠;pH 为6.5～8.0时,DMA 和MMA保留时间部分重叠;pH 为5.5～6.0时,4种砷形态可完全分离,其中,pH 6.0时分离效果最好,因此试验选择流动相的pH 为6.0。

2.2.2 流动相浓度

试验考察了流动相浓度对4种砷形态分离效果的影响,结果见图2。

图2 4种砷形态的保留时间随磷酸氢二铵浓度变化的曲线Fig.2 Curves showing changes of retention time of 4 arsenic species with concentration of potassium hydrogen phosphate solution

由图2可知:当磷酸氢二铵溶液的浓度为15～50 mmol·L－1时,随着浓度的增大,As(Ⅲ)的保留时间变化不明显,DMA 和MMA 的保留时间缓慢缩短,As(Ⅴ)的保留时间显著缩短;当磷酸氢二铵溶液浓度为45～50 mmol·L－1时,As(Ⅲ)、DMA和MMA 会发生部分色谱峰重叠;当磷酸氢二铵溶液浓度为15～40 mmol·L－1时,4种砷形态可完全分离。综合考虑分离度和工作效率,试验选择磷酸氢二铵的浓度为25 mmol·L－1,此时,4种砷形态在9 min内完全分离,色谱图见图3。

图3 4种砷形态混合标准溶液的色谱图Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution of 4 arsenic species

2.3 氢化物发生条件的优化

2.3.1 硼氢化钾质量浓度

试验考察了硼氢化钾的质量浓度对砷峰面积的影响,结果见图4。

图4 4种砷形态的峰面积随硼氢化钾溶液质量浓度变化的曲线Fig.4 Curves showing changes of peak area of 4 arsenic species with mass concentration of potassium borohydride solution

由图4可知:当硼氢化钾的质量浓度为10.0～22.5 g·L－1时,随着质量浓度的增加,4种砷形态的峰面积均显著增大;当质量浓度大于22.5 g·L－1时,峰面积增加幅度变缓,这是由于随着硼氢化钾质量浓度的增大,噪音逐渐增强所致。因此试验选择硼氢化钾溶液质量浓度为22.5 g·L－1。

2.3.2 载流种类

当载流提供的氢离子浓度为1.2 mol·L－1时,其与硼氢化钾反应产生的活性氢足够将砷还原成气态氢化物,故试验考察了盐酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液的浓度均为1.2 mol·L－1时对砷峰面积的影响,结果见图5。

图5 4种砷形态的峰面积随酸种类变化的柱状图Fig.5 Histogram showing peak area of the 4 arsenic species with acid type

由图5 可知:以盐酸溶液为载流时,As(Ⅲ)、MMA 和As(Ⅴ)的峰面积均最高,DMA 的峰面积仅次于以硫酸溶液为载流时的,因此试验选择1.2 mol·L－1盐酸溶液为载流。

2.4 标准曲线和检出限

按照试验方法测定5,10,20,50,100μg·L－1的混合标准溶液系列,以4种砷形态的质量浓度为横坐标,其对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:4 种砷形态的线性范围均为5～100μg·L－1,线性回归方程、相关系数见表2。

以3倍信噪比(S/N)计算4种砷形态的检出限(3S/N),所得结果见表2。

表2 4种砷形态的线性参数和检出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits of 4 arsenic species

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法对空白样品进行2 个浓度水平(0.25,0.50 mg·kg－1)的加标回收试验,每个加标水平测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),4种砷形态的回收率为80.0%～101%,测定值的RSD 为2.1%～5.0%。

2.6 准确度试验

按照试验方法对3 种大米粉标准物质GBW(E)100356、GBW(E)100351和GBW(E)100348进行测定,结果见表3,其中无机砷值为As(Ⅲ)和As(Ⅴ)质量分数之和。

由表3可知:3种大米粉标准物质的无机砷值和砷形态总和都在推荐范围之内,结果符合试验准确度的要求。

表3 准确度试验结果Tab.3 Results of test for accurary

2.7 样品分析

按照试验方法对大米、芥菜、空心菜、莲藕、柑橘叶片等植物样品中的砷形态进行测定,结果见表4,其中,样品总砷含量按照国家标准GB 5009.11－2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》,采用原子荧光法进行测定。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of samples

由表4可知:5种样品中都检测出了As(Ⅲ)和As(Ⅴ),部分样品检出少量DMA,但均未检出MMA。除了莲藕样品外,其他样品中As(Ⅲ)的含量均高于As(Ⅴ)的,说明大部分植物样品中的砷主要以毒性较强的As(Ⅲ)存在。4种砷形态总和与总砷测定结果基本一致,样品中砷的提取率为84.2%～104%,说明HPLC-HG-AFS 不仅可以有效分离样品中的4种砷形态,而且可以进行准确的定量分析。

本工作建立了HPLC-HG-AFS测定植物样品中4种砷形态的方法,该方法准确、简便、灵敏,适用于植物样品中4种砷形态的测定。