基于适配体的纳米金光学探针可视化法快速测定中药材中的啶虫脒

2021-03-06尤金坤魏小红陈媛媛叶淑敏余宇燕张红艳

理化检验-化学分册 2021年1期

尤金坤，魏小红，陈媛媛，叶淑敏，余宇燕，张红艳

(福建中医药大学药学院,福州 350122)

啶虫脒化学名称为N-(N-氰基-乙亚氨基)-N-甲基-2-氯吡啶-5-甲胺,属于氯化烟碱类化合物,是一种新型杀虫剂,通过作用于昆虫神经系统突触部位的烟碱乙酰胆碱受体,从而干扰刺激的传导,使神经系统通路堵塞,进而导致乙酰胆碱在突触部位积累,达到杀虫目的,被广泛应用于蚜虫、飞虱、蓟马等虫害防治中[1-3]。随着中药材产业规模化发展,大面积集中种植导致病虫害日渐严重,而啶虫脒因杀虫效果良好,且与传统的杀虫剂相比,具有毒性低的优势,被广泛应用到中药材生产种植中。但啶虫脒易残留在植物体内,进而通过食物链蓄积在人体内,可能对用药人群造成健康危害[4-5]。为了评价啶虫脒对中药材采收及使用安全性的影响,需对其残留情况进行研究及评估。

目前啶虫脒传统的测定方法为色谱法和免疫分析法[6-9]。色谱法主要依托于大型仪器进行定量分析,如气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[10-12],虽然这些检测方法已经得到广泛的应用,但是需要繁琐的样品预处理,而且所需仪器大多体积大、价格昂贵、携带困难,不适合现场快速检测。免疫分析法尽管检测快速、特异性强,但是抗体不易获取且制备周期长。因此,发展灵敏准确、快速便捷的新型传感器对啶虫脒农药残留物的测定具有重要意义。

适配体,又被称为“化学抗体”,具有目标物类别广泛、稳定性好、成本低廉且易于修饰等特点,被广泛应用于生物传感器的生物识别探针中[13]。纳米金具有许多独特的物理和光学性质,它兼具合成方法简单、性质稳定、生物亲和性好、消光系数高、易于修饰等优点。而由纳米金制备的光学探针操作方法简单,可以快速观察到结果,在各种化合物的鉴别和测定中得到了广泛应用[14]。

本工作结合纳米金与适配体的独特性质,采用纳米金作为光学探针,适配体作为识别元件,建立一种可视化纳米金比色传感器,以期实现对中药材中啶虫脒农药残留的现场快速测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Infinite M200 PRO 型多功能酶标仪;ZNCLBS型恒温磁力搅拌器;H-7650型透射电子显微镜(TEM);DFY-600型高速万能粉碎机。

氯金酸溶液:0.1 g·L－1,取1 mL 10.0 g·L－1氯金酸溶液,用水定容至100.0 mL。

柠檬酸三钠溶液:0.01 g·mL－1,称取0.101 6 g的柠檬酸三钠,用水溶解并定容至10.00 mL。

啶虫脒标准溶液:1 g·L－1,称取0.010 3 g的啶虫脒,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。其他所需质量浓度均由此溶液用甲醇逐级稀释制得。

阿特拉津、吡虫啉、毒死蜱、甲胺磷标准溶液:100 mg·L－1。

啶虫脒适配体序列:5′-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3′。

啶虫脒适配体溶液:100μmol·L－1,使用时用水稀释至所需浓度。

所用试剂均为分析纯,试验用水为超纯水。实际样品信息见表1。

表1 实际样品Tab.1 Real samples

1.2 试验方法

1.2.1 纳米金溶液的制备

采用柠檬酸还原法合成纳米金[15]。在剧烈搅拌下将100 mL 0.1 g·L－1氯金酸溶液加热至沸腾,迅速加入3 mL 柠檬酸三钠溶液,保持溶液持续沸腾10 min后,停止加热,继续搅拌15 min。待溶液冷却至室温,用0.22μm 滤膜过滤,将制备好的纳米金溶液置于4 ℃下避光保存。

1.2.2 样品中啶虫脒的测定

将中药材样品粉碎,过孔径为0.154 mm 的筛网,混匀后,取1 g于10 mL 离心管中,加入6 mL甲醇,超声提取15 min后,以3 500 r·min－1转速离心10 min。取上清液1 mL 于2 mL 离心管中,加入100 mg无水MgSO4、50 mgN-丙基乙二胺,涡旋2 min后,以8 000 r·min－1转速离心5 min,分离出样品溶液。在酶标板中加入150μL 的纳米金溶液和1.00 μmol·L－1啶虫脒适配体溶液30μL,混匀后在室温下反应15 min;在上述溶液中加入样品溶液,室温下反应20 min;再加入200 mmol·L－1的NaCl溶液30μL,混合均匀后静置5 min。通过多功能酶标仪对样品溶液进行400～700 nm 的紫外-可见吸收光谱扫描,读取各溶液在520,650 nm 处的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 试验原理

经柠檬酸根稳定的纳米金会在静电排斥作用下保持稳定,但在高盐环境下,纳米金之间的静电排斥作用会被屏蔽,从而发生聚集,导致溶液颜色发生变化。当以上体系中有适配体或啶虫脒存在时,会发生如1所示的变化。

图1 比色传感器原理图Fig.1 Schematic illustration of the mechanism of colorimetric sensor

如图1所示:适配体可以通过静电作用吸附在纳米金表面,使纳米金在高盐溶液中维持分散状态;当在纳米金-适配体体系中加入啶虫脒时,啶虫脒与适配体发生特异性结合,将适配体从纳米金表面解离下来,纳米金失去保护后,将在高盐环境下团聚,体系的颜色由红色变为蓝色。

纳米金、纳米金-啶虫脒、纳米金-适配体-盐及纳米金-适配体-啶虫脒-盐等4 种体系中纳米金的紫外-可见吸收光谱变化见图2。其中,OD 为光密度。

图2 纳米金在不同体系中的紫外-可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectrum of gold nanoparticles in different systems

由图2可知:当纳米金颗粒以分散状态存在时,最大吸收峰在520 nm 处,溶液颜色为红色;单独加入啶虫脒后,纳米金的吸收光谱和颜色均没有发生变化;加入适配体和盐溶液后,溶液颜色没有明显变化,最大吸收峰仍在520 nm 处,强度没有明显降低,这是由于适配体上的含氮碱基会与纳米金结合,从而保护纳米金免受高盐诱导,保持均匀的分散状态;加入适配体、啶虫脒和盐溶液后,体系颜色变成蓝色,520 nm 处的OD 值下降了超过一半,且在650 nm 处产生了新的吸收峰,这是由于适配体会与啶虫脒产生特异性结合,而失去保护的纳米金在高盐的诱导下发生聚集的作用。

2.2 纳米金的表征

对制备好的纳米金溶液进行400～700 nm 内的紫外-可见吸收光谱扫描和TEM 形貌表征,结果见图3。其中,图3(b)中的内插图为纳米金颗粒TEM 放大图。

由图3 可知:纳米金的特征吸收峰在520 nm处,峰形尖锐无杂峰,与文献[16]报道的一致;纳米金颗粒为圆球形,分散均匀且粒径均一,粒径约为18 nm。

2.3 试验条件的选择

2.3.1 NaCl溶液浓度

图3 纳米金的紫外-可见吸收光谱和TEM 图Fig.3 UV-Vis absorption spectrum and TEM image of gold nanoparticles

NaCl能够破坏纳米金表面的双电层,使纳米金颗粒发生团聚[17]。随着NaCl溶液浓度的增加,发生团聚的纳米金颗粒数量增多,体系的颜色会由红色逐渐变为蓝色。纳米金比色传感器中NaCl溶液浓度会直接影响整个体系灵敏度,过高NaCl溶液浓度会使纳米金在没有啶虫脒存在下发生团聚,过低NaCl溶液浓度则会导致纳米金聚集不完全,影响结果的准确度。因此,NaCl溶液浓度的选择至关重要。

按照1.2.2节试验方法(其中,用水代替适配体溶液,用甲醇代替样品溶液)考察了NaCl溶液浓度分别为0,50,100,150,200,300,350 mmol·L－1时对测定的影响,结果见图4。

由图4 可知:当NaCl 溶液浓度为50～350 mmol·L－1时,纳米金在520 nm 处的OD 值随着NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低;当NaCl溶液浓度低于200 mmol·L－1时,纳米金溶液为红色;当NaCl溶液浓度为200 mmol·L－1时,体系颜色变化明显,且520 nm 处的OD 值显著下降。因此,最终选择200 mmol·L－1的NaCl溶液开展后续试验。

2.3.2 适配体溶液浓度

按1.2.2节试验方法(其中,用甲醇替代样品溶液)考察适配体溶液的浓度分别为0,0.25,0.50,0.75,1.00,2.00,3.00μmol·L－1时对测定的影响,结果见图5。

图4 纳米金在不同浓度NaCl溶液中的紫外-可见吸收光谱Fig.4 UV-Vis absorption spectrum of gold nanoparticles in the different concentrations of NaCl solution

图5 纳米金在不同适配体溶液浓度下的OD值Fig.5 OD values of gold nanoparticles in the different concentrations of aptamer solution

由图5 可知,当适配体溶液浓度小于1.00μmol·L－1时,纳米金分散状态随着适配体溶液浓度的增加而逐渐变好;当适配体溶液浓度大于等于1.00μmol·L－1时,体系OD 值基本不再变化。因此,最终选择1.00μmol·L－1适配体溶液开展后续试验。

2.3.3 纳米金-适配体和啶虫脒-适配体作用时间

按照1.2.2 节试验方法(分别用甲醇和200μmol·L－1啶虫脒标准溶液替代样品溶液)考察纳米金-适配体作用时间分别为0,5,10,15,20,25 min,啶虫脒-适配体反应时间分别为0,5,10,15,20,30 min时对测定的影响,520 nm 处的OD 值随体系作用时间的变化见图6。

图6 2种体系作用时间对520 nm 处OD值的影响Fig.6 Effect of reaction time of the 2 systems on OD value at 520 nm

由图6可知:520 nm 处的OD 值随着纳米金-适配体作用时间的延长而增加,当作用时间达到15 min后,体系OD 值不再发生明显变化,说明体系中的纳米金与适配体已经结合完全,因此试验选择纳米金-适配体的作用时间为15 min;520 nm 处的OD 值随着啶虫脒-适配体作用时间的延长而降低,当作用时间为20 min时,OD 值没有明显变化。因此,试验选择啶虫脒-适配体的作用时间为20 min。

2.4 标准曲线和检出限

按照1.2.2 节试验方法对0,1,5,10,20,50,100,150,200,250,300μg·L－1的啶虫脒标准溶液系列进行测定。结果显示:随着啶虫脒质量浓度的增加,体系颜色逐渐由红色向蓝色转变,在20～200μg·L－1范围内,650 nm 和520 nm 处吸光度的比值与啶虫脒质量浓度呈良好的线性关系,线性回归方程为y＝3.100×10－3x＋3.105×10－1,相关系数为0.991 4。

按照1.2.2 节试验方法对样品空白重复测定8次,计算650,520 nm 处吸光度比值的标准偏差,以3倍标准偏差与标准曲线斜率的比值计算检出限,所得结果为1.13μg·L－1。