高效液相色谱法快速测定果蔬脆片中苯并(a)芘残留量

(潍坊海关,潍坊 261041)

果蔬脆片是以蔬菜、水果为主要原料,经过真空油炸生产制作的食品,其制作工艺最大程序地保存了果蔬的原味和营养成分,被认为是一种绿色食品,深受消费者的喜爱。由于经过了植物油油炸过程,果蔬脆片中的含油量一般在20%以上。油脂在高温重复使用时会产生苯并芘,如果使用这类植物油炸制果蔬脆片,其中的苯并芘会随着油炸过程迁移到果蔬脆片中。苯并(a)芘是常见的苯并芘,由5个苯环组成,结构稳定难以降解,属于高致癌物和突变原。动物试验证明,苯并(a)芘具有致癌、致畸和致突变性,其在食品、油脂、水体和土壤中广泛存在[1]。文献[2]对市售的50 种不同植物油进行检测,在18个样品中检出苯并(a)芘,检出率高达36%,其质量分数为0.69～31.72μg·kg－1。2019年7 月和8月,韩国食品药品安全处分别因苯并(a)芘超标问题[韩国标准规定苯并(a)芘限量为10μg·kg－1],命令日本HATANO SUISAN 公司停止销售并召回鲣鱼粉产品,韩国世林糙米(株)公司停止销售并召回其销售的“乐温糙米油”产品。因此,非常有必要建立油脂产品中残留苯并(a)芘的测定方法,用于指导我国相关进出口企业原料产品检验,从而保护消费者的身体健康。

目前,测定苯并(a)芘的方法主要有高效液相色谱法[3-6]和液相色谱-质谱法[7-8]。高效液相色谱法是检测苯并(a)芘的通用方法,附带的荧光检测器具有高灵敏度的特点,可以满足国家标准对食品中苯并(a)芘残留的限量要求。液相色谱-质谱法在测定苯并(a)芘时有一定的局限性,如文献[2]采用大气压光致电离源作质谱离子源,其检测灵敏度不如高效液相色谱法高,且这种离子源在常规质谱测定中使用较少,经济性、应用性和推广性均不足。但采用食品安全国家标准GB 5009.27－2016《食品安全国家标准 食品中苯并(a)芘的测定》中的液相色谱法测定苯并(a)芘时,由于果蔬脆片含油量高且成分复杂,苯并(a)芘的基质加标回收率低、结果重现性差,因此需要建立一种高效地提取净化苯并(a)芘的方法来满足对复杂油脂产品中苯并(a)芘残留量进行测定的需求。苯并芘分子印迹柱是一种亲和柱,其中特殊的分子结构和官能团可以选择性的吸附富集苯并芘,进而达到提取净化的目的[9],据此,本工作建立了一种适用性强的苯并(a)芘提取净化方法,以期为食品生产企业及相关监管部门对苯并(a)芘含量的监控提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱,配荧光检测器;5810R 型冷冻离心机;LB-W-48 型水浴氮吹仪;Milli-Q Reference型超纯水系统;GM 300 型样品研磨仪;Visiprep TM DL 型固相萃取装置;XS 205DU 型电子天平;苯并(a)芘分子印迹柱(500 mg/6 mL)。

苯并(a)芘标准储备溶液:100.0 mg·L－1,称取苯并(a)芘标准品0.010 0 g,用乙腈溶解并定容至100.0 mL,于－20℃环境下保存,有效期6个月。

苯并(a)芘标准溶液:1.0 mg·L－1,移取苯并(a)芘标准储备溶液1 mL,用乙腈定容至100.0 mL,于4 ℃保存,有效期3个月。

苯并(a)芘标准工作溶液系列:用样品溶液将苯并(a)芘标准溶液稀释至0.4,5,10,50,80,100μg·L－1,现用现配。

苯并(a)芘标准品的纯度大于99.7%;正己烷、二氯甲烷、乙腈和甲酸均为色谱纯;试验用水为一级水。

1.2 仪器工作条件

Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5.0μm),柱温40℃;荧光检测器激发波长384 nm,发射波长406 nm;流动相体积分数为90%的乙腈溶液,等度洗脱;流量1.0 mL·min－1;进样体积10μL。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

称取粉碎均匀的果蔬脆片样品5.00 g,转移至50 mL具塞离心管中,加入20 mL正己烷涡旋振荡1 min,静置5 min 后再涡旋振荡1 min,以10 000 r·min－1转速于4 ℃冷冻离心10 min,移取上清液16.0 mL至20 mL玻璃试管中,待用。

1.3.2 苯并(a)芘分子印迹柱的活化

在苯并(a)芘分子印迹柱中加入二氯甲烷5 mL,静置1 min后加入正己烷5 mL,完成对净化柱的活化。

1.3.3 样品的测定

将玻璃试管中溶液加入活化好的净化柱中,用正己烷3 mL 淋洗柱子,用二氯甲烷6 mL 洗脱,洗脱液收集到10 mL试管中,于35 ℃氮吹至近干,加入乙腈1 mL溶解残渣,涡旋振荡1 min,过0.22μm有机滤膜,滤液供高效液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

试验考察了Eclipse Plus C18色谱柱规格分别为(100 mm×4.6 mm,3.0 μm)、(150 mm×4.6 mm,5.0μm)和(250 mm×4.6 mm,5.0μm)时对测定的影响。结果显示:在使用第一种色谱柱时,柱压较高,分析物的保留时间较短,且分析物的色谱峰和杂质峰不易分离;在使用第三种色谱柱时,柱压也较高,虽然分析物的色谱峰和杂质峰能有效分离,但保留时间为16 min,不利于样品的批量快速测定;在使用第二种色谱柱时,不仅分析物能得到有效分离,且保留时间较短(8 min 左右),故试验选择Eclipse Plus C18色谱柱的规格为(150 mm×4.6 mm,5.0μm)。

试验进一步考察了流动相中的有机相分别为甲醇和乙腈时对分析物的保留时间和分离效果的影响。结果显示:以甲醇作为有机相时,分析物保留时间较长,且其峰高比乙腈作有机相时的低15%。这是由于乙腈极性较甲醇的略小,其洗脱能力更强,可缩短测定时间;同时,在同等条件下,苯并(a)芘在乙腈中受紫外照射时产生的荧光强度比在甲醇中的更高,故其响应值更高。因此试验采用乙腈作流动相中的有机相。

试验在参考文献的基础上,还考察了流动相乙腈和水的体积比分别为70∶30[4]、80∶20[5]、88∶12[9]、90∶10 和92∶8 时对测定的影响。结果显示:随着有机相所占比例的增加,分离效果变好;但当有机相的体积分数大于90%时,目标物的保留时间延长、杂峰增多,分析物峰出现拖尾,且响应值降低。综合考虑,试验选择体积分数为90%的乙腈溶液作流动相。

按照1.2节优化的色谱条件对0.4μg·L－1苯并(a)芘标准溶液进行测定,得到的色谱图见图1。

2.2 提取条件的选择

图1 苯并(a)芘标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of benzo(a)pyrene standard solution

目前国家标准和文献报道的苯并(a)芘的提取溶剂主要有乙腈[4]、正己烷[10-11]、乙酸乙酯-环己烷[2]、环己烷[12-13]、辛醇-四丁基溴化铵[14]和石油醚[15],故试验考察了上述溶剂对苯并(a)芘加标量为10.0μg·kg－1的果蔬脆片进行提取时对测定的影响。结果显示:使用甲醇、乙腈或辛醇-四丁基溴化铵提取时,苯并(a)芘的回收率低于60%;使用乙酸乙酯-环己烷和石油醚提取时,苯并(a)芘的回收率达到了75%以上,但色谱图上的干扰峰较多;使用正己烷和环己烷提取时的提取效果最好,回收率均达到85%以上,考虑到还需使用正己烷进行下一步的净化操作,故试验选用正己烷作为提取溶剂。

2.3 净化方法的选择

试验比较了Qu ECh ERS 粉[16]、中性氧化铝柱和苯并(a)芘分子印迹柱的净化效果。结果发现,在使用苯并(a)芘分子印迹柱进行净化时,分析物的分离效果和回收率均较好;而在使用QuEChERS粉、中性氧化铝柱进行净化时,分析物色谱图上产生了较多杂峰,且回收率也较低。这是由于QuEChERS粉和中性氧化铝均是通过吸附样品提取液中的杂质来达到净化目的的,净化后的样品溶液中分析物含量较低,需要进一步浓缩才能进行测定;而分子印迹柱是通过吸附苯并(a)芘到固相柱上,再通过洗脱剂将苯并(a)芘置换出来而达到净化目的的,因此选择分子印迹柱作净化柱,净化过程更加直接高效,且准确度更高。

试验还考察了洗脱剂分别为二氯甲烷、三氯甲烷、正丁醇和异丙醇时对测定的影响。结果发现,采用正丁醇作洗脱剂时,分析物的回收率偏低;采用二氯甲烷、三氯甲烷和异丙醇作为洗脱剂时,苯并(a)芘的回收率都比较理想。考虑到二氯甲烷毒性最小、沸点最低且容易获取,故试验选择用二氯甲烷作洗脱剂。

试验还发现,若将提取液全部上柱净化,提取液中的微小杂质或颗粒容易堵塞净化柱,造成净化时间延长或净化过程失效等问题,而仅定量移取上清液进行净化,净化效率明显提升。同时,在分子印迹柱活化操作中增加静置1 min这一步骤,可以显著增强苯并(a)芘回收率的稳定性和平行性。

2.4 工作曲线和测定下限

按照试验方法对苯并(a)芘标准工作溶液系列进行测定,以苯并(a)芘的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果显示:工作曲线线性范围为0.4～100μg·L－1,线性回归方程为y＝1.810×10－2x－7.710×10－3,相关系数为0.999 9。

按照试验方法对6个加标量为5.00μg·kg－1的空白果蔬脆片样品进行测定,以10倍信噪比(S/N)计算方法的测定下限(10S/N),所得结果为0.40μg·kg－1。

2.5 精密度和回收试验

在空白果蔬脆片样品中添加低、中、高等3个浓度水平的苯并(a)芘标准溶液,按试验方法测定,每个浓度水平做6个平行样,连续测定6 天,计算日内、日间回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1结果可知:苯并(a)芘的日内回收率为89.4%～93.7%,RSD 为4.3%～7.2%;日间回收率为87.6%～92.5%,RSD 为5.8%～8.4%。

2.6 样品分析

按照试验方法对20个果蔬脆片样品进行测定,结果显示,在7个样品中检出了苯并(a)芘,其质量分数为1.34～7.20μg·kg－1,符合GB 2762－2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》对油脂及其制品中苯并(a)芘限量(10μg·kg－1)的要求。

本工作建立了高效液相色谱法测定果蔬脆片中苯并(a)芘残留量的方法,该方法灵敏度高、抗干扰能力强,具有简便、快速、实用性好等优点,可以满足相关食品企业及国内外监管部门的检测需求,也可为GB 5009.27－2016提供有效的技术补充。