响应面法优化苦菜蛋白质提取工艺

贺莹

吕梁学院生命科学系（吕梁 033000）

苦菜（Sonchus oleraceusL.）系菊科苦苣菜属，一年生或二年生草本植物，茎直立或斜生，折断有白色乳汁，基生叶羽状深裂，全形长椭圆形或倒披针形，叶片边缘呈锯齿状；瘦果褐色，为长圆形，助间有横皱纹[1]。苦菜主要含有16种氨基酸，其中包括8种人体必需氨基酸，占氨基酸总量的43%，从苦菜中提取分离出的蛋白质，无动物蛋白所含的胆固醇，营养价值高，易于被人体吸收，具有十分广阔的市场潜力和前景[2-3]。

目前苦菜产品的开发正处于起步阶段，苦菜乳酸饮料[4]、苦菜复合果蔬汁、苦菜冻干粉等苦菜产品的推出深受消费者的喜爱。但苦菜在其蛋白质资源、产品加工等方面研究的深度不够，这就极大限制了对苦菜的深度应用开发。我们需要加深对苦菜蛋白质的研究，为苦菜进一步开发利用提供技术和理论支持，因此课题的研究成果有一定实用价值[5-6]。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料与设备

苦菜：采于山西吕梁田间；考马斯亮蓝G250，牛血清蛋白（BSA）；氢氧化钠、酚酞以及氯化钠分析纯，天津凤船化学试剂科技有限公司。

L550型离心机，金坛市恒丰仪器制造有限公司；LDZX-50KBS 高压蒸汽灭菌锅、HPX-9052MBE电热恒温培养箱、电热鼓风干燥箱（101-2A），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BSA224S电子天平、PHS-3E pH计，上海精密化学仪器有限公司。

1.2 试验研究方案

1.2.1 蛋白含量测定

蛋白质含量采用考马斯亮蓝法[7]测定：采用UV-3100PC型紫外可见分光光度计，以牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白，以吸光度为纵坐标率，各标准液质量浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，见图1，并建立回归方程为

式中：Y为吸光度；X为蛋白质的质量浓度，μ g/mL。

1.2.2 原料处理

将采摘的新鲜苦菜清洗干净并称质量，然后将其置于80 ℃电热鼓风干燥箱中风干5 h，将风干的苦菜用高速粉碎机粉碎，过孔径0.180 mm筛，置于一次性干燥密封袋备用[8-9]。

图1 蛋白质标准曲线图

1.2.3 苦菜蛋白质的提取工艺

提取工艺流程：原料采摘清洗→风干→粉碎→盐溶→调pH→加热浸提→过滤→离心分离→上清液（蛋白质提取液）→测定。

操作要点：准确称取1 g苦菜样品置于烧杯中，加入0.2 mol/L的氯化钠溶液，用1 mol/L的稀盐酸调节溶液pH，然后将其置于恒温水浴锅中搅拌提取[10]，一段时间后将其取出进行过滤，然后将滤液于6 000 r/min下离心15 min，3次，合并上清液，进而采用考马斯亮蓝法测定上清液中苦菜蛋白质的含量。

1.2.4 单因素试验

以苦菜中蛋白提取量为指标，研究pH、料液比、提取温度和提取时间4个因素对苦菜蛋白质提取量的影响，每个试验重复3次。

1.2.4.1 pH对苦菜蛋白质提取量的影响

在料液比1∶20 g/mL，提取温度60 ℃，提取时间2.0 h条件下，研究不同pH 2.6，2.8，3.0，3.2和3.4对苦菜蛋白质提取量的影响。

1.2.4.2 料液比对苦菜蛋白质提取量的影响

在pH 3.0，提取温度60 ℃，提取时间2.0 h条件下，研究不同料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 g/mL对苦菜蛋白质提取量的影响。

1.2.4.3 提取温度对苦菜蛋白质提取量的影响

在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取时间2.0 h条件下，研究不同提取温度55，60，65，70和75 ℃对苦菜蛋白质提取量的影响。

1.2.4.4 提取时间对苦菜蛋白质提取量的影响

在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取温度60 ℃条件下，研究不同提取时间1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h对苦菜蛋白质提取量的影响。

1.2.5 响应面试验设计

依据单因素试验结果，选取pH（A）、料液比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）4个因素，以苦菜蛋白质提取量（Y）为指标，设计四因素三水平的Box-Behnken中心组合试验[11-12]，探索苦菜蛋白质提取的最佳工艺参数。试验因素、水平见表1。

1.2.6 计算公式

1.2.7 数据处理

采用Origin 9.0绘图软件绘制单因素对苦菜蛋白质提取量的影响趋势图，采用Design-Expert 7.0软件进行响应面试验设计与分析，试验安排见表1。

表1 响应面试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 pH对苦菜蛋白质提取量的影响

由图2可知，在料液比1∶20 g/mL，提取温度60℃，提取时间2.0 h条件下，随着pH的升高，苦菜蛋白质提取量也随之发生变化，pH为3.0时苦菜蛋白提取量开始增加，pH为3.2时苦菜蛋白质提取量达到峰值；随着pH的逐渐升高，苦菜蛋白质提取量开始呈现下降趋势，因此，试验选取pH 3.2为苦菜蛋白质提取的最适pH。

图2 pH对苦菜蛋白质提取量的影响

2.1.2 料液比对苦菜蛋白质提取量的影响

由图3可知，在提取温度60 ℃，pH 3.0，提取时间2.0 h，不同料液比条件下，苦菜蛋白质提取量整体呈先增加后减少的趋势，在料液比为1∶25 g/mL时苦菜蛋白质提取量最高，其他比例蛋白提取量相对较低。综合考虑，试验选取1∶25 g/mL为苦菜蛋白质提取的最适料液比。

2.1.3 提取温度对苦菜蛋白质提取量的影响

由图4可知，在料液比1∶20 g/mL，pH 3.0，提取时间2.0 h，不同提取温度条件下，苦菜蛋白质提取量随提取温度的升高而增加，这是由于苦菜蛋白质的溶解度随温度的升高而增大。当提取温度为65 ℃时，苦菜蛋白质提取量为3.42 mg/g。提取温度达到65 ℃后，苦菜蛋白质的提取量随着提取温度的升高而继续增加，但增加的幅度明显减慢，因此，提取温度选择65℃比较合适。

图3 料液比对苦菜蛋白质提取量的影响

图4 提取温度对苦菜蛋白质提取量的影响

2.1.4 提取时间对苦菜蛋白质提取量的影响

由图5可知，在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取温度60 ℃的条件下，随着提取时间的增长，苦菜蛋白质的提取量越大，当提取时间为2.0 h时，提取效果最好。当提取时间超过2.0 h时，苦菜蛋白质提取量开始下降，说明提取时间过长会破坏蛋白质的结构，从而使得苦菜蛋白质的提取量下降。因此，试验选取2.0 h为苦菜蛋白质提取的最适提取时间。

图5 提取时间对苦菜蛋白质提取量的影响

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果

综合上述单因素试验结果，选取pH、料液比、提取温度及提取时间为考察因素，根据响应面分析法中心组合设计原理进行响应面试验，苦菜蛋白质提取工艺的响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 回归模型的建立

利用Design-Expert 7.0软件对响应面试验结果进行多元回归分析，得到苦菜蛋白质提取量与pH（A）、料液比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）的二次回归模型为

式中：各项系数的绝对值的大小表示各影响因素对苦菜蛋白质提取量的影响大小，系数的正负表示该因素影响的方向，各因素对苦菜蛋白质提取量的影响由大到小依次为B＞C＞D＞A。

对回归模型进行方差分析（表3），可以看出模型p=0.000 6＜0.01，表明该模型具有极显著性，说明条件不同，苦菜蛋白质的提取量有显著差异；失拟项p=0.134 1＞0.05，说明在试验所选各因素水平范围内，拟合程度好，此模型可用于对试验结果进行分析和预测。从表3可以看出，在试验所选各因素水平范围内，B影响极显著（p＜0.01），C影响显著，A、D影响不显著，二次项A2，B2，C2和D2对模型影响极显著。

表3 回归模型方差分析

2.2.3 响应曲面分析

由图6可知，随着提取pH的升高、料液比的增大，苦菜蛋白质提取量呈现逐渐升高后降低的趋势。由图7可知，随着pH的递增、提取温度的升高，苦菜蛋白质提取量呈现逐渐升高然后降低的趋势。由图8可知，随着提取时间的增长，苦菜蛋白质提取量呈现逐渐升高然后降低的趋势；随着pH的递增，苦菜蛋白质提取量也呈现逐渐升高后下降趋势。由图9可知，随着提取温度的升高，苦菜蛋白质提取量呈现逐渐升高然后降低的趋势；随着料液比的递增，苦菜蛋白质提取量也呈现逐渐升高后下降趋势。由图10可知，随着提取时间的增长，提取率呈现逐渐升高后降低的趋势；随着料液比的递增，苦菜蛋白质提取量同样呈现先升高后趋于平缓。由图11可知，随着提取时间的增长，提取率呈现逐渐升高后降低的趋势；随着提取温度的升高，苦菜蛋白质提取量同样呈现先升高后趋于平缓。由此可知，各因素之间交互作用的影响与单因素影响不一致，各因素间交互作用对响应值影响不显著。

图6 pH与料液比交互作用的响应面与等高线

图7 pH与提取温度交互作用的响应面与等高线

图8 pH与提取时间交互作用的响应面与等高线

图9 料液比与提取温度交互作用的响应面与等高线

图10 料液比与提取时间交互作用的响应面与等高线

图11 提取温度与提取时间交互作用的响应面与等高线

2.2.4 最佳提取条件验证

由Design-Expert 7.0软件对工艺条件进行优化，分析可得苦菜蛋白质提取量的最佳试验条件是pH为3.23，料液比1∶26.15 g/mL，提取温度65.4 ℃，提取时间2.51 h，在此条件下的理论提取量为3.5 mg/g。根据上述优化提取条件的试验结果，为了操作方便，将苦菜蛋白质的提取工艺条件调整为pH 3.2，料液比1∶26 g/mL，提取温度65 ℃，提取时间2.5 h，经过3次平行试验，得到最佳条件下苦菜蛋白质提取量为3.54 mg/g，与理论苦菜蛋白质提取量无显著性差异，由此说明通过响应面优化得到的回归方程模型及最佳条件可靠。

3 结论

以苦菜为原料，采用盐溶、酸热综合方法提取苦菜蛋白质，通过单因素试验设计，得到各因素对苦菜蛋白质提取量的影响趋势图，在此基础上通过四因素三水平响应面优化试验设计，全面且直观地分析了各因素对苦菜蛋白质提取量的影响，以及各因素之间的交互作用，建立回归模型，经验证该模型合理可靠，表明影响苦菜蛋白质提取量的主要因素是料液比与提取温度。苦菜蛋白质最佳提取工艺条件为pH 3.2，料液比1∶26 g/mL，提取温度65 ℃，提取时间2.5 h，经验证试验，得到苦菜蛋白质的提取量为3.54 mg/g。试验得到的工艺参数可为生产应用提供参考。