地克珠利纳米乳含量测定方法的建立及稳定性研究*

丁 宁，洪伟鸣，张梁秋

(江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300)

地克珠利(Diclazuril)又名氯嗪苯乙氰，属三嗪苯乙腈化合物，是一种聚酯类药物，同时也是理想的抗球虫药物，具备高效、低毒、广谱的特点[1]，广泛用于鸡、鸭和兔球虫病，在水产养殖业中也得到一定应用。地克珠利在水中几乎不溶，水溶性差成为限制地克珠利制剂发展的主要因素。纳米乳(Nanoemulsion)制剂是指粒径分布在1～100 nm，外观澄清、透明且动力学和热力学稳定的体系，其可以增加难溶性药物的溶解度，提高生物利用度[2]，包括O/W型、W/O型、B.C型，其中O/W 型纳米乳可以与水以任意比例互溶。本课题组针对地克珠利溶解度差的问题，将其溶解于适当的油相中，制备了O/W型地克珠利纳米乳，极大提高了地克珠利的溶解度，以期为地克珠利新剂型开发提供理论依据。

1 实 验

1.1 药物与试剂

Diclazuril标准品(95%，批号:fy-m0222a)，南通飞宇生物科技有限公司购买。地克珠利纳米乳(规格：20 mg/16 m:， 批号：20181210、20181211、20181212)，自研。乙腈(色谱纯，批号：r181202)，甲醇(色谱纯，批号：r181308),美国DIKMA；磷酸(分析纯，批号：20180908)，冰乙酸(分析纯，批号：20180920)，N，N-二甲基甲酰胺(分析纯，批号：20181001),国药集团。

1.2 含量测定

1.2.1 色谱条件

色谱柱为 Waters Xbridge C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈:水:磷酸:冰乙酸(54:46:0.15:0.15(V/V/V/V))；流速为1 mL/min；检测波长为 280 nm；进样量为 20 μL；柱温为 25 ℃。

1.2.2 溶液的制备

对照品储备液: 精密称取20 mg地克珠利标准品于100 mL 容量瓶中，用 N,N-二甲基甲酰胺作溶剂溶解并定容[2]，然后摇匀，此即为对照品储备液。

供试品溶液及阴性对照溶液:分别精密移取2 mL地克珠利纳米乳样品溶液和2 mL空白纳米乳样品溶液，分别置于50 mL 容量瓶中，各加入2 mL乙腈溶液，用超声波清洗机超声10 min后充分破乳，再用流动相稀释定容至50 mL，摇匀后分别作为供试品溶液及阴性对照溶液。

1.2.3 系统适用性

分别取上述三种溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样、检测，并记录色谱图。

1.2.4 标准曲线绘制

分别精密移取适量对照品储备液于适宜规格的容量瓶中，用流动相配制成浓度为2.02、4.04、10.12、20.24 和40.48 μg/mL 的对照品系列溶液，在“1.2.1”项下色谱条件下分别进样后记录色谱图。以地克利珠对照品系列溶液的浓度C及色谱峰面积 A分别作为横纵坐标，线性回归后绘制地克珠利对照品系列溶液标准曲线。

1.2.5 精密度

分别取浓度为 4.04、10. 12 和 40. 48 μg/mL 的地克珠利对照品溶液，在“1.2.1”项下色谱条件下连续进样6 次，记录色谱图，并根据峰面积并计算RSD。

1.2.6 稳定性

取批号为20181210、20181211、20181212的三批地克珠利纳米乳样品，按照“1.2.2”项下处理方法，分别制备地克珠利纳米乳供试品溶液，在室温条件下静置，于0、2、4、6、12 和 24 h取样，在“1.2.1”项下色谱条件下进样，记录色谱图，并根据峰面积并计算RSD。

1.2.7 重复性

取批号为20181210的地克珠利纳米乳样品，按照“1.2.2”项下处理方法，平行制备地克珠利纳米乳供试品溶液6份，按“1.2.1”项下的色谱条件进样，记录色谱图，并根据峰面积并计算RSD。

1.2.8 加样回收率

分别精密量取“1.2.2”项下的供试品溶液4.0，3.4 和 2.6 mL 各3份，置于10 mL 容量瓶中，分别加入浓度为20.24 μg/mL的地克珠利对照品溶液4 mL，用流动相定容并摇匀。分别制成浓度为 120%、100%、80%的加样回收率样品溶液各3 份，进样检测并根据峰面积计算加样回收溶液中地克珠利的含量，进而与理论含量进行比较，计算加样回收率和RSD。

1.2.9 供试品含量测定

取批号为20181210、20181211、20181212的三批地克珠利纳米乳样品，按 “1.2.2”项下方法，分别制备地克珠利纳米乳供试品溶液，在“1.2.1”项下色谱条件下进样，记录色谱图，每批次样品平行进样3次，根据色谱图峰面积计算地克珠利纳米乳的含量。

1.3 样品稳定性考察

1.3.1 影响因素试验

取批号为20181210、20181211、20181212的三批地克珠利纳米乳样品各3份于50 mL 透明螺口瓶中,分别进行高温(40 ℃恒温)、高湿(相对湿度为75%，温度为 25 ℃的恒温)和强光(光照强度为4000 lx)试验。以上影响因素试验样品分别在0、5、10天取样，经建立的高效液相色谱法测定含量，并观察外观有无颜色变化、分层或絮凝的现象。

1.3.2 加速试验

取批号为20181210、20181211、20181212的三批地克珠利纳米乳样品装于50 mL 透明螺口瓶中，在温度为32 ℃、湿度为65%的加速试验条件下静置6个月，分别在0、1、2、3、6月取样，经建立的高效液相色谱法测定含量，并观察外观有无颜色变化、分层或絮凝的现象。

2 结果与讨论

2.1 含量测定

2.1.1 系统适用性

图1为对照品溶液色谱图、图2为供试品溶液色谱图、图3为阴性对照溶液色谱图。由图1～图3可见，地克珠利吸收峰的保留时间为 7.7 min，供试品与对照品中地克珠利的保留时间一致且峰形较好，无明显前沿、拖尾等现象，而阴性供试品在相应位置未出现吸收峰，表明地克珠利纳米乳制备所使用的辅料对地克珠利高效液相色谱法测定含量无干扰，该方法专属性好，适用于地克珠利纳米乳含量测定。

图1 对照品溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of reference solution

图2 供试品溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of test solution

图3 阴性对照溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of negative control solution

2.1.2 标准曲线绘制

以对照品系列溶液中地克珠利峰面积 A对地克珠利的浓度 C线性回归，得绘制标准曲线 如图4所示。得线性回归方程为 A=38584C+4480.4(R2=0.9999)，地克珠利浓度在 2.02～40.48 μg/mL 范围内其线性关系良好。

图4 地克珠利标准曲线Fig.4 Dikezhuli standard curve

2.1.3 精密度

精密度试验结果见表1，数据表明该检测方法系统精密度良好，适用于地克珠利纳米乳含量的测定。

表1 地克珠利高效液相精密度试验结果Table 1 Precision test results of diclazuril by HPLC

2.1.4 稳定性

经测定，3 批样品的稳定性实验RSD值分别为 0.67%、0.55%和 0.69%，这表明地克珠利纳米乳供试品溶液在室温环境下24 h内稳定性良好。

2.1.5 重复性

根据检测结果计算，地克珠利纳米乳样品溶液的重复性RSD值为2.14%，表明本方法适用于地克珠利纳米乳样品的含量测定，且重复性良好。

2.1.6 加样回收率

根据检测结果计算，3个浓度加样回收率样品的平均加样回收率分别为100.38%、100.81%和101.87%，见表2，表明该方法用于测定地克珠利纳米乳样品加样回收率较高。

表2 地克珠利加样回收率试验结果Table 2 Test results of sample recovery of diclazuril

2.1.7 供试品含量测定

根据检测结果计算，3批地克珠利纳米乳样品含量分别为标示量的96.75%、97.79%、97.53%，见表3。

表3 地克珠利纳米乳含量测定结果Table 3 Determination results of diclazuril nanoemulsion

2.2 样品稳定性考察

2.2.1 影响因素试验

经考察，3批地克珠利纳米乳样品影响因素试验结果见表4。在高温试验条件、高湿试验条件和强光试验条件下地克珠利纳米乳外观无明显变化，澄清、透明，且无分层或絮凝等情况。高温、高湿和强光对其含量均无明显影响。

表4 地克珠利纳米乳影响因素试验结果Table 4 Test results of influencing factors of diclazuril nanoemulsion

2.2.2 加速试验

经考察，3批地克珠利纳米乳样品加速试验结果见表5。在温度为32 ℃、湿度为65%的加速试验条件下，6个月内地克珠利纳米乳样品含量稳定，外观澄清、透明且无分层或絮凝等现象。

表5 地克珠利纳米乳加速试验结果Table 5 Accelerated test results of diclazuril nanoemulsion

3 讨 论

地克珠利具有水难溶性的特点，极大的限制了制剂的发展而影响到临床应用。本实验将地克珠利制备成O/W型纳米乳，不仅提高了地克珠利的水溶性，且可以与水以任意比例混溶，提高临床应用中药物的给药均匀性。O/W型地克珠利纳米乳在含量测定时需要进行破乳，若破乳剂选择不当或超声破乳的时间和功率不足，将导致破乳不充分，影响高效液相检测峰面积，使结果偏小。

目前，国内外地克珠利含量测定通常使用紫外分光光度法[11]、液-质联用法[12]和高效液相色谱法[13]，本实验中采用高效液相色谱法，方法简单，方便快捷，实用性强。在建立高效液相色谱法测定地克珠利纳米乳中地克珠利含量的方法中，考察了甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、乙腈-冰乙酸、乙腈-磷酸-冰乙酸等流动相体系[13]，最终乙腈：水：磷酸：冰乙酸(54:46:0.15:0.15(V/V/V/V))体系作为流动相能明显改善拖尾且理论塔板数高，因此选择的流动相为乙腈：水：磷酸：冰乙酸(54:46:0.15:0.15(V/V))。