石斛酚抑制高糖诱导的视网膜血管内皮细胞凋亡及炎症反应机制

刘意 金湘东 贾宝辉 马宇 许丽敏

(1郑州铁路职业技术学院医学技术与工程学院，河南 郑州 450052；2郑州大学第五附属医院眼科；3郑州大学第一附属医院眼科)

糖尿病(DM)是一种高糖引起的血管慢性病变代谢病，其临床症状以并发症为主，包括糖尿病视网膜病、糖尿病肾病〔1,2〕。糖尿病性视网膜病变(DR)是世界失明人群的主要原因〔3,4〕，因此针对其高效低毒药物的研发具有重要意义。石斛(Dendrobii Herba)是一种传统的中草药，具有悠久的抗DM临床应用历史〔5〕，但关于石斛酚抗DM活性知之甚少。石斛或石斛酚具有抗细胞毒、抗转移的保护作用〔6〕，但其在DM引起的视功能障碍中的作用及机制尚未有报道。AKT的一般途径称为磷酸肌醇-3-激酶-蛋白激酶(PI3K-PK)B/Akt途径或PI3K/AKT/mTOR途径，以其涉及的上游和下游蛋白命名〔7〕。本研究通过建立高糖诱导的视网膜血管内皮细胞模型，观察石斛酚治疗对其凋亡、氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1材料 视网膜血管内皮细胞HREC购自ATCC；EGM2-MV内皮细胞培养基购自瑞士Lonza公司；石斛酚(批号：809AKR1B101)购自Prospec Tany Technogene Itd；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒均购自大连碧云天；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)试剂盒购自北京索莱宝公司。胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)试剂盒、ECL发光液、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司。

1.2细胞培养及分组 对照组：视网膜血管内皮细胞HREC用含有10%胎牛血清的EGM2-MV内皮细胞培养基常规培养。模型组：参考陈泰弘等〔8〕的方法，建立视网膜血管内皮细胞损伤模型。低剂量组：将模型组细胞进行50 μg/ml石斛酚处理48 h；中剂量组：将模型组细胞进行60 μg/ml石斛酚处理48 h；高剂量组：将模型组组细胞进行70 μg/ml石斛酚处理48 h。

1.3MTT法检测细胞活力 将1.2各组细胞制成混悬液，调整密度至104个/ml，然后接种至96孔板，取适量1.2各组细胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，终止培养，弃去培养液上清，然后每孔加150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡使结晶充分融解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞活性与细胞OD值呈正比。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡率 用 500 μl 的结合缓冲液悬浮细胞，分别加入5 μl Annexin V-/FITC避光反应20 min后再加入5 μl PI避光反应20 min，用300目铜筛过滤，最后在1 h内上流式细胞仪结束检测。细胞凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.5Western印迹检测细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、酶切caspase-3、PI3K、p-AKT、T-AKT的蛋白表达 取适量对数生长期1.2各组细胞，RIPA裂解后用BCA进行定量，变性离心后取上清进行蛋白上样。按照Western印迹实验常规操作流程进行电泳-转膜-封闭-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-显影曝光。Image J分析目的条带的灰度值，以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量 按照SOD试剂盒、GSH-PX测定试剂盒、MDA检测试剂盒、ROS检测试剂盒要求分别检测细胞上清液中ROS、MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.7统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞活力的影响 与对照组〔(100.00±0.27)%〕相比，模型组细胞活性〔(42.18±8.64)%〕显著降低；与模型组相比，低、中、高剂量组细胞活性〔(65.60±6.73)%、(79.58±8.04)%、(59.69±9.17)%〕显著升高，与低剂量组相比，中剂量组细胞活性显著升高，与高剂量组相比，中剂量组细胞活性显著升高(均P<0.05)。

2.2石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞凋亡的影响 与对照组相比，模型组细胞早期凋亡率和总体凋亡率显著升高(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组均显著降低(P<0.05)，与低剂量组相比，中剂量组均显著降低，与高剂量组组相比，中剂量组均显著降低(P<0.05)，见图1，表1。

图1 检测视网膜血管内皮细胞凋亡

表1 石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

2.3石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞凋亡蛋白的影响 与对照组相比，模型组细胞中酶切caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组均显著降低(P<0.05)，与低剂量组相比，中剂量组显著降低，与高剂量组相比，中剂量组显著降低(P<0.05)。见图2，表2。

1～5：对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，下图同图2 caspase-3和酶切caspase-3蛋白表达

表2 石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞凋亡蛋白的影响

2.4石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞氧化应激的影响 与对照组相比，模型组细胞中ROS、MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px含量显著降低(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组细胞中ROS、MDA含量显著降低，SOD、GSH-Px含量显著升高(P<0.05)，与低剂量组相比，中剂量组细胞中ROS、MDA含量显著降低，SOD、GSH-Px含量显著升高，与高剂量组相比，中剂量组细胞中ROS、MDA含量显著降低，SOD、GSH-Px含量显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞氧化应激的影响

2.5石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞AKT信号通路的影响 与对照组相比，模型组细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达量显著降低(P<0.05)，与模型组相比，低、中、高剂量组细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达量显著升高(P<0.05)，与低剂量组相比，中剂量组细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达显著升高，与中剂量组相比，高剂量组显著降低(P<0.05)，各组T-AKT蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图3，表4。

图3 检测视网膜血管内皮细胞AKT信号通路蛋白

表4 石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞AKT信号通路的影响

3 讨 论

细胞凋亡是维持体内细胞数量动态平衡的基础，其通过清除衰老和病变的细胞保证机体健康〔9,10〕。李雅嘉等〔11〕、徐万里等〔12〕研究报道，石斛酚对高糖诱导下的视网膜细胞、人脐静脉内皮细胞均具有明显的抗凋亡功效。研究首先构建了高糖诱导视网膜血管内皮细胞，通过石斛酚治疗后发现，石斛酚可抑制高糖诱导视网膜血管内皮细胞的凋亡及酶切caspase-3的蛋白表达，说明石斛酚对高糖诱导视网膜血管内皮细胞确实存在抗凋亡作用，为石斛酚的功能机制研究提供参考依据。Yoo等〔13〕研究报道，石斛兰中四种酚类化合物分别为4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸，且这四种酚类化合物对脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞中TNF-α的产生具有明显的抑制作用，揭示石斛酚的抗炎活性。Li等〔14〕建立了DM小鼠模型，石斛酚可有效降低小鼠血糖、体重、低密度脂蛋白和胆固醇的水平并增加小鼠胰岛素水平，改善小鼠脂肪肝和糖尿病肾病，深入研究显示，石斛酚可降低MDA含量，增加内容物的抗氧化能力，另外还有降低IL-6和TNF-α表达的抗炎作用，首次揭示了石斛酚改善小鼠DM及其并发症的功能，其机制可能与石斛酚的抗炎、抗氧化应激有关。本研究结果表明，石斛酚可抑制高糖诱导视网膜血管内皮细胞中促炎因子的分泌，促进抗炎因子的分泌，发挥明显的抗炎作用，与Li等〔14〕研究结果一致，揭示了石斛酚在高糖诱导视网膜血管内皮细胞中的抗炎作用及石斛酚在DM并发症中的潜在治疗价值。

AKT家族激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶，属于AGC激酶的一般类别(蛋白质的AMP/GMP激酶和PKC亚家族)，其在人类中具有518个成员，且哺乳动物Akt的结构和功能高度保守〔15～19〕。 陈泰弘等〔7〕报道，在高糖低氧诱导的视网膜微血管内皮细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路得到明显抑制，经过银杏内酯B治疗后该通路被异常激活，细胞的凋亡和炎性损伤能力被抑制。本研究结果说明AKT信号通路被明显抑制，与陈泰弘等〔7〕研究结果相一致；深入研究发现，经石斛酚治疗的高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞中PI3K、p-AKT的表达明显升高，AKT信号通路再次得到激活，甚至活性恢复到正常细胞水平，说明石斛酚治疗功能的作用机制与激活AKT信号通路密切相关。