外源性趋化因子CXC配体1促进肝癌细胞恶性行为的作用机制

秦梓棋 程瑶 翁金如 湖连涛 李玥 王伟群

(佳木斯大学 1检验医学院，黑龙江 佳木斯 154002；2口腔医学院；3基础医学院)

肝癌包括肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)和其他罕见肿瘤，其中最主要的是纤维状层状癌和肝母细胞瘤〔1,2〕。研究显示，2018年肝癌的新发病例为841 000例，病死高达782 000例〔3〕。流行病学研究表明，肝癌发生有明显地域差异，北欧和北美地区发病率较低，而亚太地区则高发〔4〕。中国已经成为肝癌的重灾区，有超过50%肝癌患者来自于中国〔5〕。目前认为，许多危险因素包括乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酒精摄入、肝病史和吸烟等已被证实与肝癌发生率升高具有显著相关性〔6〕。据统计，在病毒相关性肝癌中，75%～80%的肝癌发生与HBV感染有关，10%～20%与HCV感染有关，这表明炎症反应和免疫应答在肝癌发生与发展过程中具有重要作用〔7〕。

趋化因子是由细胞分泌的一类蛋白信号分子，因其具有诱导反应细胞做定向移动和趋化的能力，故名趋化因子。根据位于氨基端两个保守半胱氨酸残基的排列方式不同，趋化因子可分为CXC、CC、C和 CX3C四个亚家族〔8〕。在CXC亚家族中，又根据功能区第一个半胱氨酸前是否存在谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)氨基酸结构，把其分为ELR+CXC和ELR-CXC〔9〕。趋化因子的功能实施主要是由G蛋白耦联7次跨膜趋化因子受体介导的，趋化因子与其受体间存在复杂的对应关系，1个受体可以结合多个配体，如CXCR1可结合CXCL6和CXCL8；反之，1个配体也可有多个受体，如CXCL6的受体有CXCR1和CXCR2，这种混乱的对应关系构成了趋化因子间复杂的细胞网络系统〔10〕。此外，趋化因子也可结合非G蛋白耦联7次跨膜受体的非典型趋化因子受体(ACKR)，该受体虽然不能介导常规趋化因子受体的信号通路，但可经清除趋化因子而调控趋化因子在组织中的浓度。迄今为止，人们已识别出近50种趋化因子，它们可分别经20种G蛋白耦联趋化因子受体和4种ACKR发挥生物学功能〔11〕。

趋化因子的主要生理功能是在炎症及免疫应答中调控和诱导多种粒细胞的激活、趋化及迁移。此外，趋化因子还被认为在淋巴组织的发育、免疫细胞的成熟及适应性免疫应答的产生和传递过程中发挥重要作用。趋化因子及其受体的表达失调可涉及许多人类疾病，其中包括自身免疫性疾病、炎症性疾病和恶性肿瘤〔11〕。炎性细胞浸润几乎是所有恶性肿瘤的基本特征之一，而趋化因子在引导炎性细胞向肿瘤微环境内积累起着关键作用。慢性炎症易导致肿瘤的形成和发展，原因之一是由趋化因子吸引来的炎性细胞，在肿瘤微环境中可提供促进肿瘤发展的生长因子和血管生成因子〔12〕。但越来越多的证据也表明趋化因子对表达趋化因子受体的肿瘤细胞具有直接作用。肿瘤微环境中的肿瘤细胞、间质细胞及趋化来的炎性细胞等均可释放多种趋化因子，细胞间可经自分泌和旁分泌途径影响肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭并诱导肿瘤微环境中的血管发生〔12〕。本研究探讨外源性CXCL1对肝癌细胞恶性行为的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验细胞、材料及仪器RPMI1640 培养基、胎牛血清(FBS)和Transwell小室(美国Corning公司)，BEL-7402肝癌细胞(美国模式菌种收集中心)，重组人CXCL1(美国PeproTech公司)，兔抗BCL-2多克隆抗体(中国Affinity公司)，鼠抗AKT单克隆抗体和鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(中国Abways公司)，细胞计数试剂(CCK)-8和二辛喹酸(BCA)蛋白定量试剂盒(中国武汉博士德生物公司)，胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，细胞培养瓶、培养板(美国Corning公司)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Milipore公司)，辣根过氧化物酶(HRP)耦联二抗(中国北京中杉金桥公司)，增强化学发光(ECL)试剂(美国Thermo公司)，放射性免疫沉淀法分析(RIPA)蛋白裂解液(上海碧云天生物公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂(北京索莱宝公司)，图像采集及分析系统、EPS300电泳仪、蛋白电泳槽和转膜槽(上海天能公司)，全自动多功能酶标仪(美国BIO-TEK公司)，倒置光学显微镜(日本奥林巴斯公司)，高速冷冻离心机(德国Beckman公司)。

1.2细胞增殖实验 将BEL-7402肝癌细胞按2×103个/孔接种到96孔板各孔中；将孔板中的细胞分为3组，每组10孔，各组所用的培养基分别为含0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1和10%FBS的RPMI1640完全培养基；将细胞置于含5%CO2的37℃培养箱中培养72 h；向各孔中分别吸入10 μl CCK-8试剂，然后在含5%CO2的37℃培养箱中继续培养2 h；将孔板置于酶标仪中读取450 nm波长的光密度值。

1.3细胞迁移实验 将BEL-7402肝癌细胞按1×104个/孔接种到Transwell上室各孔中；将孔板中的细胞分为3组，每组4室；各组上室中的培养基分别为含0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1的无血清RPMI1640培养基，而下室均为含10%FBS的RPMI1640完全培养基；将细胞置于含5%CO2的37℃培养箱中培养24 h；用脱脂棉签擦拭小室上表面以去除未迁移细胞；利用甲醇结晶紫染色后，自来水冲洗、晾干，在倒置微镜下拍照并计算迁移细胞数。

1.4Western印迹实验 将BEL-7402肝癌细胞按1×106个/孔接种到6孔板各孔中；将孔板中的细胞分为3组，各组所用的培养基分别为含0、5、10 ng/ml外源性CXCL1和10%FBS的RPMI1640完全培养基；将细胞置于含5%CO2的37℃培养箱中培养72 h；胰蛋白酶消化细胞后将细胞悬液转移至离心管中；低速离心机中离心5 min(800 r/min)以收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入200 μl RIPA蛋白裂解液和2 μl PMSF，剧烈吹打以保证细胞完全裂解；将离心管置于4℃高速冷冻离心机中离心20 min(15 000 r/min)；将上层液体移入新的离心管中，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；吸取40 μg总蛋白在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳；将蛋白转移到PVDF膜上；用5%脱脂奶对膜封闭60 min；磷酸缓冲液-吐温(PBS-T)洗涤3次×5 min，将膜在4℃冰箱中分别用Bcl-2(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)一抗孵育过夜；PBS-T洗涤3次×5 min，将膜在37℃中用HRP耦联二抗(1∶10 000)孵育30 min；PBS-T洗涤4次×8 min；将膜用ECL试剂孵育并置于凝胶成像系统中显影和拍照。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1外源性CXCL1促进BEL-7402肝癌细胞增殖 细胞培养72 h后，CCK-8增殖实验显示，0、5和10 ng/ml 外源性CXCL1处理组的光密度值分别为(0.71±0.11)、(0.82±0.12)、(1.24±0.36)。与0 ng/ml处理组比较，5、10 ng/ml处理组显著增高(P=0.000 4；P=0.000 0)，说明外源性CXCL1可显著促进BEL-7402肝癌细胞的增殖能力。

2.2外源性CXCL1促进BEL-7402肝癌细胞迁移 细胞培养24 h后，Transwell迁移实验显示，0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1处理组的细胞迁移数分别为(104.75±15.92)个、(111.50±6.86)个、(248.00±53.17)个。与0 ng/ml处理组比较，10 ng/ml处理组显著增高(P=0.002 1)，说明外源性CXCL1可显著促进BEL-7402肝癌细胞的迁移能力。

2.3外源性CXCL1上调BEL-7402肝癌细胞Bcl-2和AKT蛋白表达 0、10 ng/ml 外源性CXCL1处理组细胞的Bcl-2相对表达量分别是(0.32±0.11)和(1.35±0.21)，两者差异显著(P=0.001 5)；0、10 ng/ml 外源性CXCL1处理组细胞的AKT相对表达量分别是(0.94±0.11)和(2.89±0.40)，两者差异显著(P=0.001 2)。见图1。

图1 外源性CXCL1上调BEL-7402肝癌细胞Bcl-2和AKT蛋白表达

3 讨 论

趋化因子是一类分子量为8～12 kD的细胞因子超家族成员，具有广泛的生物学作用，在免疫细胞和骨髓造血细胞的生成、分化、发育及免疫应答的调控等过程中发挥重要作用，还参与炎症、自身免疫性疾病和肿瘤等多种疾病的病理生理过程〔13〕。

目前认为，趋化因子可经多条信号转导通路调控肿瘤细胞增殖及存活。如趋化因子可通过活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路，调控生长相关基因如细胞周期蛋白(cyclin)D1〔14〕、即刻早期反应因子(Egr)-1〔15〕、原癌基因(Fos)〔16〕、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)〔17〕基因的表达而促进肿瘤细胞增殖。此外，趋化因子也可通过影响凋亡相关基因的表达来打破凋亡/抗凋亡之间的平衡，从而实现其促增殖活性，如上调p53结合蛋白同源物(Mdm2)〔18〕和Bcl-2〔19〕基因的表达，下调半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-7和肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)10C基因的表达〔20〕。所有实体肿瘤都需要血管系统来提供营养，如果没有新生血管的形成，肿瘤在缺少血供的情况下既不能迅速增大，也不能向远处转移。在趋化因子家族中，CXC类趋化因子对血管具有重要的调控作用，它们可经MAPK/ERK、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT和Wnt/β-连环蛋白(Catenin)等多条信号转导途径影响肿瘤的血管生成〔21,22〕。通常情况下，ELR+CXC 类趋化因子(如CXCL1、CXCL3、CXCL5和CXCL8等)可通过表达于内皮细胞上的CXCR2受体促进内皮细胞的增殖，进而导致血管生成。而ELR-CXC类趋化因子(如CXCL4、CXCL9和CXCL10等)则可经抑制内皮细胞的趋向性而抑制血管生成〔23〕。趋化因子及其受体在肿瘤细胞侵袭、转移中亦发挥关键的调控作用，如Itatani等〔24〕发现在结直肠癌中多种趋化因子/受体轴如CXCL1/CXCR2、CXCL9/10/CXCR3、CXCL12/CXCR4、CCL2/CCR2、CCL5/CCR5和CCL15/CCR1等均可参与肿瘤细胞的侵袭和转移活性。

CXCL1又名GRO-α，属于ELR+CXC类趋化因子，其主要通过与其细胞膜上特异性受体CXCR2结合而发挥生物学作用。研究表明，CXCL1在许多人类肿瘤中表达上调，并且其表达上调与肿瘤的高临床分期、分级、远处转移和总体生存期具有显著相关性〔25〕。功能研究显示，肿瘤细胞分泌的高水平CXCL1可引导肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和肿瘤相关成纤维细胞(CAF)趋化至肿瘤微环境中，而来源于肿瘤细胞、TAM和CAF的CXCL1可经自分泌的旁分泌途径促进肿瘤的增殖活性〔26〕。Payne等〔27〕报道CXCL1、CXCL2和CXCL3等趋化因子对黑色素瘤细胞的生长有直接促进作用，在体外应用特异性抗体阻断CXCL1 或其受体CXCR2，黑色素瘤细胞生长受到抑制。

Yang等〔28〕研究表明，肝癌细胞表达趋化因子CXCL5及其受体CXCR2，当外源性给予或过表达CXCL5可经旁分泌及自分泌途径促进肝癌细胞的增殖及迁移能力。既然CXCL1与CXCL5共享同一受体CXCR2，提示CXCR2介导的信号通路参与肝癌的发生与发展进程，可能部分是通过其另一配体CXCL1发挥作用的。本文结果表明，不同浓度的外源性CXCL1可分别促进BEL-7402肝癌细胞的增殖和迁移能力。进一步机制研究表明，外源性CXCL1还可上调BEL-7402肝癌细胞Bcl-2和AKT蛋白的表达。作为一种重要的凋亡相关基因，Bcl-2可通过抑制细胞凋亡途径，来促进细胞存活和细胞分裂，因此在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用〔29〕。PI3K/AKT是细胞内重要的信号转导通路，在多种人类肿瘤中，该通路的异常激活可参与和调控肿瘤细胞的增殖、迁移及代谢等过程〔30〕。研究表明AKT 亦可抑制肿瘤细胞凋亡，这与其磷酸化下游凋亡相关分子如 Bcl-2、caspase家族成员有关〔30〕。

综上，外源性CXCL1可经活化Bcl-2/AKT抗凋亡途径促进肝癌细胞的恶性进程。