TSHR、HPV16 E6蛋白在老年宫颈癌组织中表达及与疾病发生发展的关系

张娟 李娜娜 陈蕊 李国浩 沈承承 王鸿雁

(济南市妇幼保健院 1妇产科，山东 济南 250000；2产科病房；3山东省卫生健康宣传教育中心健康促进科；4山东省精神卫生中心儿童青少年二病区；5济南市妇幼保健院妇科；6山东大学)

宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一，近年来年轻患者的发病率持续上升，严重影响女性的健康〔1〕。宫颈癌的发生及治疗越来越受重视，其发病是多种因素综合作用的结果，与早婚、早育、多产、病毒感染有关。随着分子病毒学发展，有研究发现，人乳头瘤病毒(HPV)是引起宫颈癌的重要致病因子〔2〕。其中HPV16 E6基因能编码具有转化活性的原癌蛋白质，可诱发强烈的T细胞效应，对宫颈癌病变至关重要〔3〕。按与癌症发生的关系将HPV分为低危型、中危型和高危型，E6、E7作为HPV16主要的致癌基因，可使抑癌基因失活，激活原癌基因，破坏细胞周期，导致细胞增殖和凋亡失调，导致肿瘤形成〔3〕。促甲状腺激素受体(TSHR)是调控甲状腺细胞生长、分化的主要受体，在肺癌、结肠癌、前列腺癌等肿瘤组织中高表达〔4〕。已有研究表明，TSHR和HPV16可能在宫颈癌发生中起协同作用，共同参与疾病发生发展。目前关于其在宫颈癌组织中表达情况的相关研究还较少，本研究通过检测宫颈癌肿瘤组织HPV16 E6蛋白及TSHR蛋白表达情况，旨在探讨其与宫颈癌发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2013年12月至2015年6月济南市妇幼保健院手术切除的宫颈癌组织标本102例为研究组，平均年龄(68.69±5.48)岁，病理标本均经病理科确诊为鳞癌组织。纳入标准：①诊断符合国际妇产科联合会(FIGO)分类标准和世界卫生组织(WHO)分级标准〔5〕的鳞状宫颈癌患者；②患者术前未接受放射治疗、化疗及生物免疫治疗；③患者及家属签署知情同意书。排除严重肝、肾疾病、糖尿病患者。收集宫颈炎组织标本100例为对照组，平均年龄(67.52±4.68)岁。两组年龄无统计学差异(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1样本采集 所有宫颈组织于离体后30 min内取材，-80℃保存。

1.2.2HPV16 E6蛋白及TSHR蛋白表达情况检测 利用免疫组织化学链霉菌抗生物素过氧化物酶(SP)法检测所有受试者宫颈组织TSHR和HPV16 E6蛋白表达情况，SP试剂盒及显色剂均购自北京中山生物技术有限公司，操作步骤按试剂盒要求进行，HPV16 E6蛋白阳性对照为试剂盒中HPV16 E6蛋白阳性模板的宫颈鳞癌组织切片，阴性对照为正常宫颈组织；TSHR用磷酸盐缓冲液代替一抗做空白对照。HPV16 E6蛋白阳性表达定义为细胞质内出现棕黄色颗粒，TSHR阳性表达定义为细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒；组织切片由2名经验病理科医师采用双盲法阅片，染色学评分：高倍镜下随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，其中阳性细胞率：>75%评分3分，26%～75%评分2分，5%～25%评分为1分，<5%评分0分。评分1分以上为阳性表达。

1.3统计学分析 采用SPSS20.0软件进行χ2检验、Spearman相关分析、Kaplan-Meier法、Log-Rank检验、COX回归分析。

2 结 果

2.1两组HPV16 E6蛋白与TSHR蛋白表达情况比较 宫颈癌组织中HPV16 E6蛋白〔66.67%(68/102)〕与TSHR蛋白表达阳性率〔68.63%(70/102)〕均显著高于对照组〔20.00%(20/100)和27.00%(27/100)，P<0.05〕。见图1，表1。

图1 宫颈癌组织中HPV16 E6蛋白与TSHR蛋白表达情况(SP法，×200)

表1 不同特征宫颈癌患者肿瘤组织HPV16 E6蛋白及TSHR蛋白阳性表达比较(n)

2.2宫颈癌患者肿瘤组织HPV16 E6蛋白及TSHR蛋白表达与临床资料比较 HPV16 E6阳性表达与宫颈癌患者年龄、临床分期、病理分级、肿瘤体积及淋巴结转移无关(P>0.05)；TSHR阳性表达与宫颈癌患者年龄、临床分期、肿瘤体积及淋巴结转移无关(P>0.05)；肿瘤分化程度越高，TSHR蛋白表达阳性率越高(P<0.05)。见表1。

2.3宫颈癌患者肿瘤组织HPV16 E6蛋白、TSHR表达相关性 HPV16 E6蛋白阳性表达的68例宫颈癌患者中，TSHR表达阳性为59例，而HPV阴性表达的34例中，TSHR表达阴性为22例，HPV16 E6蛋白表达与TSHR表达情况明显正相关(rs=0.533，P=0.002)。

2.4宫颈癌肿瘤组织HPV16 E6蛋白、TSHR蛋白表达对患者3年存活情况的影响 整理随访资料发现，术后3年，共有61例(40.20%)患者幸存。Kaplan-Meier生存分析表明，HPV16 E6蛋白阳性表达患者3年总生存率为55.88%，与HPV16 E6蛋白阴性表达者(67.65%)无显著差异(χ2=1.791，P>0.05)；TSHR蛋白阳性表达患者3年总生存率为 51.429%，显著低于TSHR阴性表达者(78.125%；χ2=6.315，P<0.05)。见图2。

图2 宫颈癌肿瘤组织HPV16 E6蛋白、TSHR蛋白表达对患者3年存活情况的影响

2.5影响宫颈癌患者预后危险因素分析 单因素分析显示，肿瘤体积、淋巴结转移、TSHR表达情况均是影响宫颈癌预后的危险因素。多因素分析表明，肿瘤体积、淋巴结转移、TSHR蛋白阳性表达是影响患者预后的独立危险因素(均P<0.05)。见表2。

表2 影响宫颈癌患者预后危险因素分析

3 讨 论

宫颈癌在发展中国家发病率居高不下，在妇科恶性肿瘤中死亡率高居第2位，严重威胁女性健康〔6〕。宫颈癌的发生、发展是正常宫颈上皮细胞由增生到癌变的极其复杂过程，由多种因素参与调控。大量研究表明，HPV感染与宫颈癌发生、发展关系密切，高危型HPV能在体内激活使端粒延长的端粒酶，诱导细胞永生化〔7〕。目前发现约有13种高危型HPV型，以HPV16最为常见，70%的宫颈癌与感染HPV16或HPV18相关〔8〕。TSHR调控甲状腺细胞生长、分化，其水平异常可能与肿瘤发生有关。

HPV基因组为环状双链DNA，包括早期区、晚期区和长控制区，其中早期区维持基因复制、细胞内病毒高拷贝数、编码病毒蛋白，含有E1、E2、E4、E6、E7共6个基因〔9〕。HPV 的致癌作用与HPV DNA整合有关，感染病毒后，宿主细胞与病毒核酸整合，整合后的DNA通过致癌基因E6、E7与细胞周期调控蛋白相互作用，干扰细胞周期调控，使细胞无限增殖，发展为癌细胞〔10〕。有研究表明，感染高危型HPV的宫颈癌患者宫颈组织E6、E7 编码的蛋白可上调端粒酶活性，导致未分化的上皮细胞永生化〔11〕。本研究结果表明感染HPV16 E6蛋白与宫颈癌发病密切相关，与上述研究结果一致。另有研究表明，HPV16编码的E6原癌蛋白可通过E6结合蛋白与抑癌基因蛋白p53结合，促进p53降解，有利于肿瘤生成、发展〔12,13〕。HPV16致癌作用是一个复杂的过程，目前尚未完全清楚，有待进一步研究。本研究还提示HPV16感染可能只是宫颈癌的致癌启动因子，与病情进展及预后无显著相关性。

TSHR通过与促甲状腺激素(TSH)结合后调控甲状腺功能、促进甲状腺滤泡细胞的生长分化，是糖蛋白激素家族成员之一，在甲状腺细胞的增殖、代谢调控中起主导作用〔14〕。TSH可通过细胞膜表面的TSHR刺激甲状腺激素合成和分泌，而甲状腺激素在维持女性正常生殖内分泌功能及性腺发育中起关键作用〔15〕。TSHR蛋白在多种恶性肿瘤组织中高表达，提示其过表达可能与肿瘤增殖分化有关〔16〕。有研究发现，TSHR蛋白在甲状腺乳头状癌组织中高表达〔17,18〕。本研究结果提示TSHR蛋白过表达与宫颈癌发生有关。TSHR蛋白阳性表达可反映患者预后不良，对TSHR阳性表达患者加强术后监测，改变治疗方案，可能避免不良预后。单因素分析结果表明TSHR蛋白阳性表达与宫颈癌的发生密切相关。Spearman相关分析显示，HPV16 E6蛋白与TSHR蛋白表达情况明显正相关，HPV16 E6蛋白作为HPV16病毒转录翻译的主要蛋白之一，一定程度可反映HPV16病毒感染情况，提示HPV16感染与TSHR蛋白表达协同作用，共同参与癌症发生和发展，影响患者预后，但其具体机制不清楚，尚有待研究。