山茶籽对雌激素缺乏AD大鼠脑组织形态、β淀粉样蛋白及学习行为能力的影响

周善金 李海 顾建忠 韦福相 邱迎均 潘春玲 黎飚 方晓燕

(右江民族医学院组织胚胎学教研室，广西 百色 533000)

阿尔茨海默病(AD)患病率随着年龄增大明显升高，老年女性发病率更高，临床表现更重。沉积于海马区β淀粉样蛋白(Aβ)引起思维、语音中枢的损伤是AD的病因之一〔1～3〕。本研究主要观察山茶籽提取物对雌激素缺乏AD模型鼠的学习行为能力、对应组织的Aβ沉积的影响，为临床防疗AD提供新的治疗方案，无毒高效地提高AD女性患者生活质量，使茶麸变废为宝，为广大山区脱贫绿色生态产业带来经济效益和社会效益。

1 材料与方法

1.1实验动物饲养 SD大鼠，SPF级5月龄雌性大鼠32只，体重(350±10)g。在室温(25±3)℃、灯光每12 h 进行交替，相对湿度58%的条件中给予全效颗粒饲料喂养，自由饮水。

1.2雌激素缺乏AD大鼠模型的建立 取24只大鼠在麻醉条件下(10 g/L 戊巴比妥钠通过腹腔注射，3.0 mg/kg)，常规消毒，切掉两侧卵巢，缝合创口。切片镜下鉴定切除组织块为卵巢。术后创口处用链霉素治疗3 d，避免创口感染。去卵巢后2 w，按上述方法麻醉(3.0 mg/kg)，固定于脑定位器上，头颅正顶部中央切前囟口暴露脑组织，以前囟为中心，向后4.3 mm、再旁开2.1 mm两边为穿刺点，打孔钻开颅骨。距离脑膜表面针入3.0 mm到达海马区双侧，用Aβ25～35 1 μl(含量为10 μg)缓缓注入海马区双侧，留针片刻(5 min)，使Aβ25～35充分局部浸润。③造模大鼠颅内注射3 d后，再用D-半乳糖腹腔注射，注射液用D-半乳糖(100 mg/kg)+生理盐水稀释至2 ml，1次/d，连续2 w。对照组大鼠与去卵巢+D-半乳糖联合造AD模大鼠的摘除卵巢的手术操作过程一样，不同是切除卵巢附近一块脂肪组织，同样定位开颅，在相应部位注射等量盐水，没有注射Aβ25～35。

1.3动物分组及给药 造模+山茶籽干预(山茶籽)组用相当于生药5 g/g山茶籽的水溶液定时定量灌胃〔10 ml/(kg·d)〕；造模+雌二醇干预(雌二醇)组用雌二醇皮下注射200 μg/kg,2次/w；对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。各组造模后均给药12 w。

1.4Morris水迷宫试验 各实验大鼠在造模后给药前及给药12 w时全部进行Morris 水迷宫，测定大鼠学习行为能力。在水迷宫中央放置圆形的平台深度位于1.5 cm水下处，测定大鼠空间行为能力和空间判断记忆能力。

1.5免疫组化观察不同组海马区脑组织切片Aβ阳性细胞 灌注排血取脑，麻醉大鼠后，切开胸腔心脏，用500 ml生理盐水快速灌注。灌注后断头常规取脑，左脑用10%甲醛固定脑组织，脱水、包埋和切成脑组织片。右大脑匀浆测定Aβ。海马区脑组织切片免疫组化染色，将海马区脑组织切片室温中干燥1.5 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，每次20 min。将山羊血清(混有0.1%TritonX-100)注入组织片上并进行35～50 min孵育。滴入抗Aβ抗体(1∶400)4℃条件下孵育一夜。第2天，用Cy3 标记的二抗体(1∶200)在湿盒中进行2～3 h孵育。最后，免疫染色切片显微镜观察切片阳性细胞，进行Aβ阳性细胞计数。

1.6Western印迹法检测Aβ 右侧海马区组织在低温条件下进行匀浆并提取Aβ进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。凝胶置电泳槽里，并注入缓冲电泳液检查其密封性。向电泳样本加入适当5×结合缓冲液,煮沸时间10 min，进行离心分离。在泳道注入40 μg Aβ，蛋白条带至中间部位即可断电。剪滤纸与聚偏氟乙烯(PVDF)膜一样大小，并在甲醇溶液中浸泡PVDF 膜5 min左右，夹子内部海绵、滤纸、凝胶板、PVDF 膜、滤纸按顺序排列。通电90 min，电压100 V电泳。室温转膜后，5%牛奶液中进行封闭2 h，加入一抗孵育4℃过夜(其中兔抗Aβ单克隆抗体1∶400；兔抗大鼠β-actin 多克隆抗体1∶10 000)。用TBST洗涤3次。加入酶标记兔二抗(1∶20 000)孵育2 h。同样洗涤3次。观察凝胶成像，扫描观察灰度。

1.7统计学方法 采用SSPS19.0软件进行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1各组大脑组织结构比较 对照组神经细胞大小、分布和数量正常，模型组神经细胞数量减少，大量神经元纤维缠结，而山茶籽组和雌二醇组的神经细胞大小、分布和数量与对照组相近。见图1。

图1 各组大脑组织结构(HE，×100)

2.2各组脑组织Aβ蛋白表达比较 见图2。模型组Aβ电泳条带较对照组显著增强，山茶籽组及雌二醇组Aβ条带与对照组接近。

2.3各组水迷宫实验 见表1。对照组给药前后到达时间和错误率没有显著差别(P>0.05)；模型组治疗前后到达时间和错误率有显著差别(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，山茶籽组及雌二醇组治疗后错误率均明显降低(P<0.01)；与雌二醇组比较，山茶籽组用药后错误率无明显差异(P>0.05)。

图2 Western印迹检测各组Aβ蛋白表达

表1 各组到达中央平台时间和错误率比较

2.4各组海马区组织切片Aβ阳性细胞计数比较 与对照组〔(8.33±0.62)个〕比较，模型组海马区组织切片Aβ阳性细胞计数〔(72.10±8.79)个〕显著增多(P<0.01)；与模型组比较，山茶籽组〔(21.32±3.05)个〕及雌二醇组〔(17.19±1.03)个〕Aβ阳性细胞计数显著减少(P<0.01)。

3 讨 论

去卵巢模拟老年女性卵巢功能退化加常规用D-半乳糖+Aβ联合造AD模，结果AD模型大鼠学习行为和记忆能力下降明显,海马组织Aβ沉积增加明显，其阳性细胞增加，相应 Aβ电泳带光密度明显增加，说明此方法造AD模成功。

雌激素缺乏AD模型经山茶籽提取液干扰后，大鼠记忆行为和学习能力提高,海马区组织神经细胞数量增加，神经纤维缠结减少，海马区Aβ免疫组织化学染色显示Aβ染色细胞数量下降，说明山茶籽对AD大鼠治疗效果显著，山茶籽发挥雌激素样作用抑制胆碱酶，增加胆碱在脑组织的生理活性浓度，提高脑中枢组织生理活动〔4〕，从而表现为学习行为和记忆能力提高；雌激素大量羟基发挥抗氧化功能〔5〕，抑制半乳糖和Aβ沉积物对神经组织的伤害，抑制AD发生和发展；雌激素有扩张血管，增血流的功效，减少Aβ对脑组织在大脑组织堆积、神经纤维缠结和老年斑生成〔6，7〕；山茶籽发挥其雌激素样作用增加中枢神经细胞α酶的分泌，加快Aβ水解、排出，AD自然得到改善〔8〕。

综上，山茶籽干扰AD大鼠效果良好，其原理是内含丰富植物性雌激素。与雌二醇治疗比较，山茶籽治疗AD作用效果相近，也从另一方面说明山茶籽内含雌激素〔9〕，而且山茶籽无雌激素的毒副作用，为老年女性AD防治提供新方案，还可以发挥山茶籽绿色生态扶贫产业作用。