染料木素在实验性狼疮性肾炎中的作用及机制

舒峤 方卫东 任称发

(赣州市人民医院肾内科，江西 赣州 341000)

狼疮性肾炎(LN)是以补体大量激活，免疫复合物在肾小球内沉积，肾小球增生和硬化，肾组织炎症反应为特点的系统性红斑狼疮(SLE)所导致的肾损害〔1〕。LN是导致SLE患者终末期肾脏病的首要原因，尽管激素及免疫抑制剂能够改善部分LN患者预后，但仍有大量的LN患者进展为终末期肾病〔2〕，极大增加了患者的经济负担，影响患者生活质量。现有研究表明免疫调节失衡是LN发生发展的重要环节，肾内炎性细胞和炎性因子的大量浸润导致不可逆肾损害是LN的主要原因。因此，寻找调节自身免疫功能潜在方法，通过抑制炎症反应对于开发LN治疗药物至关重要。染料木素作为一种大豆异黄酮类植物雌激素，在肿瘤、糖尿病、心血管疾病中均能发挥作用，其中抗炎作用最为突出〔3〕。有研究显示，染料木素通过调节炎症介质来改善环磷酰胺诱导的肝毒性〔4〕。Abron等〔5〕发现染料木素能够诱导巨噬细胞极化及调控全身炎症因子，从而改善结肠炎。染料木素通过抑制巨噬细胞核因子(NF)-κB的活化，改善脂多糖诱导的炎症反应〔6〕。既往研究证实，NF-κB激活后，促进肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β的表达与分泌，显著促进LN的发展〔6〕。鉴于染料木素有调节免疫反应的功能，且染料木素在LN中作用未见报道，因此，本研究拟通过MRL/lpr构建LN小鼠模型，观察染料木素对LN的影响并探讨可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 本实验所用一抗均来自Cell Signaling Technology(Beverly,MA USA)公司。染料木素(纯度≥98%)购自上海融禾公司，ELISA试剂盒购自上海蓝基生物公司，染色试剂盒由北京海德创业公司提供。

1.2方法

1.2.1动物及实验分组 实验动物均由南京大学-南京生物医药研究院提供。实验遵守实验动物规范条例。分为对照组：15只C57BL/6雌性小鼠，盐水灌胃8 w；模型组： 15只纯种MRL/lpr 雌性小鼠，盐水灌胃8 w；治疗组：15只纯种MRL/lpr 雌性小鼠，染料木素灌胃100 mg/(kg·d)治疗8 w〔7〕。

1.2.2尿蛋白检测 根据BCA试剂盒检测方法，通过代谢笼收集小鼠第10周、第12周、第14周、第16周和第18周尿液标本，使用 BCA 蛋白浓度检测试剂盒进行。

1.2.3免疫球蛋白(Ig)G 沉积 通过免疫荧光观察IgG在肾内沉积情况。使用冰冻切片滴加 Alexa Fluor-546 标记的 IgG 抗体，室温避光孵育2 h。封片后拍照分析。

1.2.4苏木素-伊红(HE)染色 石蜡切片脱蜡后HE染色，观察肾小球硬化、增生及炎症细胞浸润。

1.2.5ELISA检测 收集小鼠肾脏组织及血清，根据ELISA试剂盒检测方法，配置梯度标准品与检测试剂，96孔板种加入样品及对照品，每孔100 μl，一抗过夜孵育后加入辣根过氧化物酶(HRP)-Streptavidin工作液，室温孵育后苯胺(TMB)显色，最后加入终止液 50 μl，酶标仪检测分析各组血清及肾组织中抗ds-DNA、IL-1β、TNF-α尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)的含量。

1.2.6Western印迹 小鼠肾脏组织匀浆后提取蛋白。通过核蛋白提取试剂盒分离核蛋白。上样、电泳、转膜、封闭后加入一抗〔IκB的磷酸化(p-IκB)、NF-κB、F4/80、趋化因子配体(CCL)2、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1〕。过夜孵育加入二抗后电化学发光剂(ECL)显色，检测并分析。

1.3统计学分析 采用SPSS18.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1尿蛋白测定 第10周、第12周、第14周模型组与治疗组小鼠尿蛋白无明显差异(P>0.05)，而第16周、第18周尿蛋白检测结果显示染料木素治疗能够明显降低治疗组尿蛋白含量(P<0.05)，而模型组尿蛋白含量呈时间依赖性升高(P<0.05)。见表1。

表1 两组尿蛋白水平比较

2.2肾脏组织HE染色 经过染料木素干预后，治疗组小鼠肾脏肾小球硬化、增生及炎症浸润情况明显缓解，而模型组较对照组相比上述肾小球病理改变明显加重。见图1。

图1 各组肾脏组织病理学观察(HE，×400)

2.3IgG沉积情况 模型组小鼠肾小球IgG的荧光强度(123.2±17.1)与对照组(21.2±0.1)相比明显增加，说明模型组小鼠肾小球大量IgG免疫复合物沉积，而染料木素干预后治疗组小鼠肾小球IgG荧光强度(54.5±7.4)较模型组明显降低(P<0.05)，结果说明染料木素能够降低免疫复合物在肾小球中的沉积。见图2。

2.4血清抗ds-DNA、BUN、Cr水平 模型组较对照组ds-DNA、BUN、Cr水平明显增加(P<0.05)，而染料木素干预降低治疗组小鼠其血清抗ds-DNA、BUN、Cr水平，说明染料木素降低SLE所导致的肾损伤(P<0.05)。见表2。

图2 各组肾小球IgG免疫荧光染色(×400)

表2 各组抗dsDNA、BUN、Cr水平比较

2.5染料木素影响NF-κB的激活 模型组细胞质中p-IκB与对照组相比显著增加，通过提取核蛋白进行检测发现模型组相较于对照组NF-κB p65入核增加(P<0.05)，表示NF-κB活化在模型组中被显著激活。治疗组小鼠经过染料木素干预后抑制了p-IκB，并且抑制了NF-κB p65的入核(P<0.05)，结果表明染料木素能够通过抑制NF-κB的激活干预LN的发生发展过程。见图3，表3。

图3 p-IκB与NF-κB在细胞核内外的表达

表3 p-IκB 与NF-κB在细胞核内外的表达

2.6染料木素对炎症的影响 模型组与对照组小鼠相比，肾组织内F4/80、CCL2、NLRP3和Caspase-1蛋白表达明显增加(P<0.05)，进而说明炎症细胞及炎症因子参与了LN的发生发展。而治疗组抑制炎症相关蛋白的增加(P<0.05)，提示染料木素抑制NLRP3的表达从而抑制了LN肾组织的炎症细胞浸润和炎症因子的产生。见图4，表4。

图4 炎性蛋白在肾组织中的表达

表4 炎性蛋白相对表达定量

2.7染料木素对炎症因子TNF-α和IL-1β的影响 染料木素干预后能够明显抑制SLE小鼠肾组织及血清TNF-α和IL-1β的增高(P<0.05)。见表5。

表5 肾组织与血清TNF-α及IL-1β水平

3 讨 论

LN是导致SLE患者肾衰竭的主要原因。虽然目前已开发出多种免疫抑制剂治疗LN，但仍有部分患者进展为终末期肾脏病，严重威胁了LN患者生命与健康〔8，9〕。目前研究认为免疫调节失衡是LN发生发展的关键。蛋白尿是LN肾功能恶化早期表现，本研究结果说明染料木素能够改善肾小球的结构，恢复肾小球的功能，进一步解释染料木素降低LN导致的蛋白尿增加。

以往的研究显示NF-κB的激活与LN免疫失衡密切相关〔10〕。NF-κB是关键的炎症启动因子，其激活有赖于IKKβ活性使IκB磷酸化，激活后NF-κB进入细胞核内促进炎症反应。研究显示通过使用在IKK选择性抑制剂抑制NF-κB活性，能够限制改善LN导致的肾损伤〔9〕。在肾小管损伤研究中发现，抑制NF-κB能明显缓解缺氧诱导的大鼠肾小管损伤〔11〕。同时，泛素结合蛋白ABIN1能够负向调节NF-κB的活化〔12〕。利用ABIN1无活性小鼠研究发现，失活后的ABIN1刺激NF-κB活化，进而促进LN进展〔13〕。因此，NF-κB信号激活是LN发生发展的关键因素。本研究发现，染料木素能够显著抑制IκB磷酸化，LN导致的NF-κB核转位明显被抑制，因此染料木素可能通过抑制NF-κB的活化减轻LN导致肾损伤。

既往研究显示，NF-κB是炎症小体NLRP3的上游分子，促进NLRP3的激活从而介导LN的发生发展〔14〕。有文献报道，通过抑制NLRP3在MRL/lpr小鼠中的表达，能够减轻LN介导的肾脏炎症反应〔14〕。NLRP3作为Caspase-1的上游，能够激活Caspase-1的活化。以往研究表明，通过敲除Caspase-1能够抑制LN的活动进展，并且抑制P2X7受体能够显著降低LN中NLRP3和Capase-1的表达，影响IL-1β的表达与活化，延缓LN肾功能恶化〔15〕。CCL2是巨噬细胞重要的炎症趋化因子，促进其在肾脏组织内浸润，巨噬细胞分泌炎症因子参与LN的发生发展过程〔16〕。本实验发现染料木素能够抑制Caspase-1的激活及IL-1β和TNF-α的产生与释放，同时能够减低单核细胞趋化因子CCL2的表达，抑制巨噬细胞在肾脏内浸润，减轻肾小球增生和硬化，达到保护LN肾功能的目的。染料木素抑制LN发展可能的机制是抑制NF-κB/NLRP3轴的激活，从而抑制LN肾内的炎症反应，恢复肾脏内免疫平衡，保护肾脏结构和功能。