关于单核细胞增生李斯特菌毒力因子、致病机理和毒力检测技术的综述

◎ 陶 飞，林 慧，颜春荣，徐春祥

（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210000）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种重要的食源性人畜共患病原菌，广泛存在于土壤、植物、污水中，易造成对肉制品、海产品、牛奶蔬菜的污染。该菌是兼性厌氧的革兰氏阳性菌，耐低温（-1.5～45 ℃可生长，-20 ℃下可以存活1年）、耐高盐、可以形成生物膜，对环境的适应能力很强，可以存在于食品的原料、加工、运输、冷藏过程中[1-2]，因此检测和控制食品中的单核细胞增生李斯特菌比较困难。LM易感染孕妇、老人、婴儿等免疫力低下的人群。感染后的主要症状较轻为胃肠炎，较重为脑膜炎、败血症、坏死性肝炎等[3]。由LM引起的食源性疾病发病率不高，死亡率却高达20%～30%[2]。

食源性单核细胞增生李斯特菌来源不同，毒力和致病性也不同，为单核细胞增生李斯特菌的检测及控制带来了困难，因而分析单核细胞增生李斯特菌的毒力和致病性规律，对更好的检测和控制单核细胞增生李斯特菌有重要的指导意义。本文将从4方面对其主要毒力因子展开综述，分别为与环境抗逆相关的毒力因子、与黏附侵袭相关的毒力因子、与胞内感染相关毒力因子以及毒力调控因子。接着从毒力因子致病的机理综述了单核细胞增生李斯特菌致病的过程，最后对国内外单核细胞增生李斯特菌毒力检测方法进行介绍。

1 单核细胞增生李斯特菌的关键毒力因子

1.1 与环境抗逆相关的毒力因子

细菌进入宿主的消化道后，要承受胃酸环境和胆酸盐、非特异性炎性因子和蛋白水解酶的破坏作用。胆酸盐水解酶（BSH）可以分解已经结合的胆酸盐，保护细菌不会受到胆酸盐的杀伤作用。BSH由bsh基因编码，受到转录活化因子prfA的正向调节，也受Sigma B因子的控制[4-5]。一些应激应答因子比如Lmo1421、OpuCA等则被发现是通过各自的途径保证细菌在消化道内能够存活。也有一些与渗透压耐受相关的因子可以产生几种渗透物摄取系统，如甜菜碱转运子BetL和Gbu、肉碱转运子OpuC[6]。

1.2 与黏附侵袭相关的毒力因子

细菌通过与黏附和侵袭相关的毒力因子入侵细胞。内化素是一类与黏附侵袭相关性很大的毒力因子，它能够识别宿主细胞上的受体，从而完成细菌对靶细胞的内化入侵[7]。除了内化素，溶血素LLO（hly）、细胞壁水解酶（P60）、酰胺酶（Ami）、纤连蛋白结合蛋白A（FbpA）、肌动蛋白聚集因子（ActA）和自溶素（auto）等毒力因子都协同参与了细菌的黏附和侵袭[8-9]。此外，MANDIN等人发现dlt操纵子也是一种与黏附和侵袭相关的毒力因子，当缺失该操纵子时，细菌的黏附侵袭能力明显降低[10]。

1.3 细胞内感染相关毒力因子

单核细胞增生李斯特菌在真核细胞内的感染周期与多个因素相关，包括它在细胞内的生存、增殖能力及在细胞间的扩散能力。在溶血素（LLO）和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶（PlcA）的裂解作用下，LM可以从吞噬小体逃离进入细胞质中，在己糖磷酸盐转运蛋白（Hpt）的作用下，利用细胞质中的营养成分进行增殖[11]。还可以借助肌动蛋白聚集因子（ActA）实现细菌在细胞内和细胞间的扩散，其中磷脂酰肌醇特异性卵磷脂酶（PlcB）和LLO介导细胞膜的裂解。细菌被临近的细胞吞噬后，便又开始了新一轮的感染[11-12]。

1.4 毒力调控因子

单核细胞增生李斯特菌的大多数重要毒力基因都受转录活化因子PrfA调控。在染色体一个9kb区域上存在一个LIP-1毒力岛，由于LIPI-1毒力岛上基因的表达全部受PrfA调控，因此该毒力岛又称PrfA依赖型毒力基因簇。第二毒力岛LIPI-2又称内化素岛，其绝大部分内化素基因也都受PrfA的调控[9]。而应答调控因子VirR是仅次于PrfA的第二大毒力调控因子，调控了12个毒力基因，分别是mprF、dltA、dltB、dltC、dltD、LMo2114和LMo2115等[13]。其 编 码 基因缺失后，LM对小鼠的毒力降低，同时对培养细胞Caco-2的侵袭力也显著降低[14]。此外Sigma B是对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子，在极端pH、高渗透压、低温、氧化和葡萄糖限制的条件下，sigma B被激发，从而生成100多种抗逆蛋白质[15]。

2 单核细胞增生李斯特菌的致病机理

2.1 单核细胞增生李斯特菌在宿主体内的感染

食源性的LM可以随污染的食物经口腔进宿主的消化道，大部分细菌被胃酸杀死，只有一小部分细菌能够进入肠道系统，并在肠道内增殖，其中有一部分通过粪便直接排出体外，并且再次污染食物、水源以及饲料等，形成一个完整的粪口传播途径[16]。

未排出体外的LM可以很快的穿过肠道上皮细胞屏障进入机体的肠道深层，该过程不会对肠道上皮造成损伤，通过M细胞进入肠道深层后，再通过血液循环或淋巴循环被转移到肝脏[17]。LM能穿过血脑屏障引起脑膜炎等神经症状，还可以穿越胎盘屏障，造成流产或新生儿溶血[18-19]。

2.2 单核细胞增生李斯特菌在细胞间的感染

LM在细胞间的感染过程及其致病过程分为3个阶段。

（1）LM被吞噬细胞吞噬，在内化素A（InlA）、内化素B（InlB）、P60蛋白等黏附分子的作用下与黏附蛋白受体结合，黏附于细胞上。一旦LM黏附到细胞表面之后，就可以通过拉链机制进入宿主细胞（“拉链式”是指细菌表面配体与宿主细胞膜受体结合，激活胞内信号通路，造成肌动蛋白骨架重排引发细胞膜对菌体的渐进包裹吞噬，而不是肌动蛋白骨架大规模重组）[9,20]。酰胺酶（Ami）和肌动蛋白聚合蛋白（ActA）等协同参与细菌的黏附侵袭，这一过程是细胞间感染的前提。

（2）LM在磷脂酶A（PlcA）、磷脂酶B（PlcB）和溶血素（LLO）的协同作用下裂解吞噬体膜。进入细胞质后，细菌在LM己糖磷酸盐转运蛋白（Hpt）的作用下摄取养分存活增殖[21]。现阶段LM逃离吞噬小体机制的相关研究还不太完善，目前主要有两个有共通之处的理论可以解释这个机制。①第一种理论认为LLO可以介导磷脂酶C的亚细胞定位发生变化，从而接触到位于内膜上的底物磷脂使其发生降解[12]。②第二种理论认为发育成熟的吞噬小体长时间暴露在胞浆中可以被溶酶体溶解，而LLO可以通过在发育后期的吞噬小体上打孔以延迟其成熟，从而使Plc有充足的时间将吞噬体膜裂解，用RNA干扰的方式阻碍宿主细胞中参与内吞小体和溶酶体融合的蛋白的表达，使得缺失LLO的LM逃离吞噬小体[22]。

（3）LM在肌动蛋白聚合蛋白（ActA）的辅助下在细胞内运动，并伸出伪足向邻近的细胞扩散，使细菌在宿主细胞间传播。具有运动能力的LM移动至细胞膜，可以在膜上形成突起，伸向另一个细胞，再被临近的细胞吞噬，这一过程不会造成细胞裂解，这样LM就可以不用暴露在胞外环境中。LM在另一个细胞内形成有两层膜包裹的次级吞噬小体，最终再次通过LLO、PLC等的膜裂解作用逸入宿主细胞质中，并开始新的细胞内感染周期[21]。现在仍然不清楚细菌是否可以区分初级吞噬小体和次级吞噬小体从而对毒力基因的表达作出相应的调整，但是可以确定PLC在LM逃离次级吞噬小体机制中有着更为重要的作用。

3 单核细胞增生李斯特菌毒力检测技术

目前，单核细胞增生李斯特菌毒力检测主要包括体内毒力实验、体外细胞实验、基因水平检测和蛋白水平检测。小鼠毒力实验为体内检测细菌致病力的方法，但实验成本高，且耗时。体外培养细胞实验相对于小鼠毒力实验成本较低，且操作简便，虽然具有重要的细菌毒力预测价值但相对费时。随着单核细胞增生李斯特氏菌及无害李斯特氏菌全基因组序列的测定技术的发展，己鉴定出若干新的毒力相关基因，使通过毒力基因检测单核细胞增生李斯特菌的致病力的目标得以实现。

3.1 体内毒力实验

体内毒力实验是用动物实验来评估微生物毒力和致病性。小鼠是最早和最适合作毒理试验的动物，但其他动物比如豚鼠、兔子和灵长类动物也有被用于测试单核细胞增生李斯特菌的毒力[23]。将单核细胞增生李斯特菌悬液通过口服，腹腔、静脉和皮下注射等方式感染小鼠体，通过计算死亡率来测定毒性，可以得到药物半数致死量（LD50）。通过比较不同菌株作用下小鼠的LD50值，就可以粗略的判断毒性强度。也有人通过研究其在感染小鼠脏器如脾脏等的分布和增殖情况来确定细菌毒力[21]。

3.2 体外细胞实验

体外细胞实验比动物实验成本低，包括J774或者人类结肠癌细胞Caco-2毒性试验，HT-29、Henle407或L2细胞的空斑形成试验、鸡胚模型毒力试验和Caco-2细胞侵袭及胞内增殖试验[24-25]。细胞实验的原理是检测单核细胞增生李斯特菌对细胞的黏附、侵袭能力以及在细胞中生长和传播的能力。

3.3 毒力基因的PCR技术

单核细胞增生李斯特菌基因组中存在许多毒力基因，这些毒力基因存在与否影响着细菌的致病性强弱。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是早期发展起来的一种分子生物学检测技术，近几年，PCR技术因其特异性强、稳定性高、重复性好等优点已成为检测单核细胞增生李斯特菌毒力基因的常规手段。单核细胞增生李斯特菌毒力基因存在部分特异性片段，PCR方法就通过对该片段设计并选择相应的特异性引物，从而对单核细胞增生李斯特菌的主要毒力基因进行选择性扩增，并从琼脂糖电泳图上比对扩增片段大小，或进一步对扩增片段进行测序比对[26-27]。为了进行更准确的检测，多重PCR在毒力检测中也发挥着重要作用[28]。同时，随着近年来测序成本的降低，使用DNA测序来分析单核细胞增生李斯特菌的毒力已经成为一种简单快捷的方法。我们可以通过对不同单核细胞增生李斯特菌株进行DNA测序，通过分析基因组信息，从基因水平的差异来探究不同菌株表型和致病性等方面的相似性和差异性。致病菌株和非致病菌株之间可能会由于基因水平的转移或基因缺失、插入或突变导致表型的变化[29]。DNA测序是一种准确、便捷、稳定的测定毒力的方法，可以从基因水平层面揭示观测到的毒力效果。

3.4 蛋白水平检测

单核细胞增生李斯特菌分泌的一系列和毒力有关的蛋白质，与其致病性有很大关联。一些基因突变株会产生一些没有功能的蛋白质，或者某些毒力基因没有表达，未产生毒力蛋白，导致菌株的毒力下降，因而检测毒素蛋白也是检测单核细胞增生李斯特菌毒力的一种辅助方法[30-31]。例如蛋白质印迹（western印迹法），曾被报道用于检测毒力大质粒编码的蛋白。这是根据抗原抗体的特异性结合检验样品中某种蛋白质的方法，因其具备高特异性和敏感性的特点，现已经成为蛋白分析的一种常规技术[32]。同样，酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）也被成功地用于多种致病菌的免疫诊断，具有灵敏、特异、简单、稳定以及易操作等特点[31]。但在对单核细胞增生李斯特菌的检测中，常将ELISA与PCR联合起来用于检测毒力基因，而不是用来检测毒素蛋白。在PCR-ELISA中PCR扩增时，引物用抗原标记，这样扩增产物中就会有抗原。扩增产物与微孔上的捕获探针杂交，捕获靶序列，再加入酶标记的抗体，使抗体与靶序列上的抗原结合，然后加入底物显色，从而可以实现定量检测[33-34]。

4 结语

近些年，欧美国家爆发了多起由单核细胞增生李斯特菌引起的食源性疾病，对食源性单核细胞增生李斯特菌的检测控制，对其致病机理、毒力因子的深入研究得到了多个国家政府的支持。伴随着多学科交叉发展，单核细胞增生李斯特菌毒力的检测正向综合方向发展，即层次水平的检测，包括基因水平、基因表达水平、蛋白水平以及这些水平的联合检测，未来的发展方向将更精确、更快捷、更灵敏。

现有的研究已经对单核细胞增生李斯特菌的十几种主要毒力因子的结构、功能、侵袭性、致病性等作出了比较全面的诠释。随着对单核细胞增生李斯特菌的深入研究，单核细胞增生李斯特菌耐酸、耐高盐、耐低温有关的毒力因子也不断被研究人员发现。研究其对极端条件的抗性机理，对于开发出破坏单核细胞增生李斯特菌抗性的方法有指导意义；对其他与单核细胞增生李斯特菌致病机理密切相关的毒力因子，特别是毒力调控因子的研究，更能为预防单核细胞增生李斯特菌引起的食源性疾病的检测和控制提供理论依据。因此，单核细胞增生李斯特菌的相关研究有待进一步的开展。