铁死亡在肝癌中的调控机制及作用研究进展

罗羽田，李世朋，徐红伟，王 迎，王建国

（新乡医学院第一附属医院肝胆外科，河南 卫辉 453100）

肝癌具有恶性程度高、进展快、预后差等特点。在全世界范围内，肝癌的致死率在癌症中居第2位，且其发病率逐年上升［1］。肝癌患者早期无典型症状，确诊患者大多已属于晚期，肝癌患者的5 a生存率不足10%，其中无法进行手术治疗的患者生存期仅6个月［2］。在手术、射频消融术、放射治疗、化学治疗等多种治疗手段下，肝癌细胞仍能通过逃避死亡而进行增殖、侵袭及转移，因此，将肝癌治疗的突破口转向分子靶向治疗是一种新发现的趋势。铁死亡是一种新的程序性细胞死亡方式［3］，其与铁依赖的脂质过氧化代谢有关，通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH/H+）、多不饱和脂肪酸代谢、谷氨酰胺分解代谢途径调节细胞死亡。靶向药物索拉非尼是一种铁死亡诱导剂而非细胞凋亡诱导剂，这可能为临床药物治疗肝癌提供了新思路。基于此，本文就铁死亡在肝癌中调控机制、信号通路及作用的研究进展进行综述。

1 铁死亡的由来

爱拉斯汀（erastin）是第1个被发现的铁死亡诱导物。DOLMA等［4］在2003年发现了一种抗肿瘤药物，可在不引起细胞核形态改变、DNA 断裂和caspase3活化的情况下诱导细胞死亡，且caspase抑制剂无法逆转该过程。YANG等［5］研究发现了导致这种新型细胞死亡方式的化合物RSL3、RSL5，并发现铁螯合剂可以抑制这种死亡方式［6］。DIXON等［2］在2012年用erastin研究RAS突变的人纤维肉瘤细胞时观察到，细胞中脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS）明显增加，细胞出现分离及死亡，加入铁离子抑制剂后，细胞死亡数量显著下降；加入外源性的铁离子后，细胞死亡数量增加；提示人纤维肉瘤细胞死亡与铁离子的浓度相关。该研究还发现，在ROS聚集一段时间内，使用抗氧化剂同样可以抑制该过程。根据这一特点，DIXON正式将这种新的程序性细胞死亡方式命名为“铁死亡”。

2 铁死亡的特点

铁死亡是一种新型的非凋亡性、非坏死性的铁依赖性细胞死亡方式，其形态学的特征主要包括细胞核完整，染色质未聚集，原生质膜未破裂起泡，线粒体减小或消失，外膜破裂、内膜密度增高。除了形态学特征，肿瘤细胞铁死亡中的信号通路也不同于细胞凋亡、坏死途径［2］。控制铁死亡的基因不同于控制其他细胞死亡方式的基因，主要包括核糖体蛋白质L8、铁反应元件结合蛋白2、F0复合亚基C3、柠檬酸合成酶（citrate synthetase，CS）、四肽重复域35、人酰基辅酶A合成酶2线粒体6种蛋白质编码基因，这些基因通过调节铁离子水平来控制铁的吸收、代谢和储存［9］。铁死亡的生物化学特征为脂质过氧化氢和亚铁离子浓度升高。细胞内的脂质氧化物在铁离子的催化下出现异常代谢，其产生出的大量脂质破坏了原有的氧化还原平衡，进而攻击生物大分子，导致细胞死亡，具体表现为谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的失活和脂质过氧化物沉积［8］。半胱氨酸利用率、谷胱甘肽（glutathion，GSH）生物合成、多不饱和脂肪酸代谢以及磷脂的调节是铁死亡途径的关键因素［10］。

3 铁死亡与肝癌

3.1 铁死亡与肝癌的发生发展铁是维持机体正常活动的重要微量元素，参与人体氧转运、电子传递，髓鞘的形成，DNA复制、修复及酶促反应等重要生理过程［11］。肝脏是储存、代谢铁的重要脏器，铁平衡对维持人体正常生理功能具有重要作用。食用含血红素铁的肉类、使用铁锅烹饪、大剂量应用维生素C［12］、嗜酒（红酒中含铁较多）、长期使用含铁较多的药物，均能导致体内铁含量过载［13］。肝脏产生的铁调素通过对细胞内铁的吸收、输出、利用、储存，调节体内铁水平并维持其平衡［11］。铁过多的沉积累及到肝脏时，会造成肝损伤并进一步引起肝小叶纤维化、肝硬化、肝癌。铁还促进了酒精对肝的损害，这与铁催化氧化反应、加强脂质过氧化反应、激活贮脂细胞有关。欧洲流行病学研究发现，血色素沉着病伴有乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎患者发生肝癌的概率大大增加［14］。GABUTTI等［15］报道，长期使用鳌合剂可以逆转铁过载导致的并发症（如肝纤维化）。肝纤维化是细胞核、细胞质和其他细胞器（如溶酶体）出现不可修复的功能障碍后的继发反应［16-20］。铁死亡被认为是一种强的肿瘤生长抑制剂［21］，在结肠癌、肺癌、中枢神经系统恶性肿瘤、黑色素细胞瘤、卵巢癌和乳腺癌等癌症中，铁死亡的作用增强了肿瘤对化学治疗药物的敏感性［22］。但铁死亡在肝癌中的确切作用尚未完全阐明，多项研究发现，索拉非尼（一种用于肝癌治疗的多激酶抑制剂）在肝癌衍生细胞系中的细胞毒性作用可以通过诱导氧化应激和铁死亡来解释，而并非之前认为的多激酶抑制肝癌细胞增殖、血管生成并加快肝癌细胞凋亡的形式［23-24］，表明在药物诱导肝癌细胞死亡的机制中，铁死亡起着关键的作用［25-26］。

3.2 铁死亡在肝癌中的信号通路

3.2.1 p62-Keap1-Nrf2信号通路调控铁死亡核因子红系相关因子2（nuclearfactor erythroidderived 2-like 2，Nrf2）是抗氧化反应和诱导细胞防御系统的重要调节因子［27］。生理条件下，Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1）有助于维持低水平的Nrf2，刺激其泛素化和蛋白酶体降解［28-29］，而在氧化应激反应过程中，Nrf2蛋白被解除抑制并保持稳定，这个过程受到自噬受体p62的严格控制。p62可直接抑制Keap1，同时促进Nrf2的激活。有研究证明，p62-Keap1-Nrf2通路的激活可使铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1，FTH1）表达上调，FTH1通过储存、转运肝癌细胞内Fe2+，从而抑制肝癌细胞发生铁死亡［30］。还有研究发现，在转录水平和翻译水平上，石榴乳状液介导的Nrf2的上调可能与大鼠肝脏组织中管家基因mRNA表达升高有关［31］。管家基因表达的升高可能导致代谢谱的改变，并降低致癌反应中间体的细胞水平，从而导致肝癌的发生［32］。采用药物5-氨基咪唑-4-甲酰胺1-β-D-呋喃糖苷通过诱导Nrf2基因表达调节肝癌细胞的氧化还原状态，可减轻肝细胞损伤［33］。上述研究结果显示，通过调节p62-Keap1-Nrf2信号通路减轻氧化损伤来治疗肝癌具有巨大潜力。

3.2.2 p53信号通路调控铁死亡p53介导的细胞周期阻滞、衰老和凋亡是抑制癌症发生的关键。p53可通过直接抑制二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）的活性或促进细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（cyclindependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A/p21）的表达来抑制铁死亡。在无p53的情况下，DPP4和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶相互作用形成复合体，然后增加脂质过氧化和铁死亡［34］。通过对突变小鼠的研究发现，p53可抑制胱氨酸的摄取，提高细胞对铁死亡的敏感性［32］。通过抑制胱氨酸/谷氨酸转运体关键成分SLC7A11的表达，保留了调节SLC7A11表达的能力，从而对ROS诱导的应激产生铁依赖［35］。SLC7A11在人肝癌细胞中的高度表达可抑制ROS诱导的铁死亡。在p53基因突变的小鼠模型中发现，这种基因突变增加了患癌的风险［36］。有研究发现，下调SLC7A11和诱导铁死亡可能是抑制突变小鼠肿瘤发展的机制之一［37-38］。

3.2.3 视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）信号通路调控铁死亡Rb蛋白作为一种负性调节因子，通过调节转录因子E2F家族的活性来调节细胞增殖和细胞周期进程，并在G1/S检查点中发挥重要作用［39］。Rb蛋白功能的丧失是肝癌发生的一个重要过程［40］，Rb水平降低的人肝细胞癌细胞暴露于索拉非尼后，细胞死亡诱导率增加2～3倍［41］。肝癌细胞的Rb阴性状态可促进索拉非尼诱导的铁死亡的发生［41］。肝癌细胞的Rb基因状态对索拉非尼诱导肝癌细胞铁死亡具有重要意义，通过干扰短发夹RNA使肝癌细胞Rb基因沉默，可显著增强索拉非尼诱导肝癌细胞铁死亡效应和抑制肿瘤的作用［27］。

3.2.4 重组人CDGSH铁硫结构域1（iron sulfur domain 1 protein，CISD1）调控铁死亡铁死亡的发生伴随线粒体的形态变化［2］。YUAN等［42］人发现了CISD1。CISD1位于线粒体外膜，负调控铁死亡。CISD1的铁硫簇可抑制肝癌细胞中线粒体对铁的吸收及脂质过氧化，从而阻断铁死亡。说明CISD1对肝癌患者线粒体损伤有保护作用，通过靶向抑制CISD1来诱导铁死亡发生，可为肝癌治疗提供新的方向。

3.2.5 MT-1G调控铁死亡有研究表明，MT-1G是一种重要的铁死亡调控因子，是人肝癌细胞对索拉非尼耐药的一个靶点［43］。MT-1G是铁死亡负性调节因子，可增加肝癌细胞对索拉非尼的耐药性，导致肝癌患者预后不良［44］。降低MT-1G可增加GSH耗竭和脂质过氧化，从而促进索拉非尼诱导的铁死亡。研究发现，调节MT-1G的表达水平可以对铁死亡产生调控作用［45］。血清中MT-1G高表达预示肝癌患者采用索拉非尼治疗的预后差、总体生存期短，其对判断肝癌预后具有重要的临床意义。

3.2.6 肝癌细胞脂质代谢调控铁死亡

3.2.6.1 低密度脂蛋白二十二碳六烯酸（low-density lipoprotein docosahexenoic acid，LDL-DHA）调控铁死亡有研究发现，LDL-DHA可诱导铁死亡［46-47］。LDL-DHA对大鼠肝癌细胞和人肝癌细胞均有细胞毒性作用，表现为脂质过氧化沉积、还原型GSH耗竭、GPX4蛋白活性丧失。LDL-DHA可直接降解GPX4，LDL-DHA纳米颗粒还可通过减少对GSH/氧化型GSH、NADPH/NADP+以及GSH-醛加合物的氧化还原反应来降低细胞内GSH 的含量［48］，使GPX4不能发挥酶活性。综上所述，LDLDHA通过铁死亡途径诱导肝癌细胞死亡，这是LDL-DHA纳米颗粒具有抗癌活性的一种新的分子机制。LDL-DHA诱导铁死亡的机制有待进一步研究，以供未来开发更多新型抗癌药物。

3.2.6.2 长链脂酰辅酶A合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4）调控铁死亡脂质代谢氧化在铁死亡中起着至关重要的作用，ACSL4可能是检测铁蛋白酶活性的一种具有潜在价值的生物标志物。此外，ACSL4是铁死亡的正调控因子，ACSL4的下调抑制了erastin诱导的肝癌细胞HepG2的铁死亡，这与ACSL4介导的5-羟基二十碳四烯酸脂肪毒性的产生相关。脂毒性可以通过脂质中间体的积累导致细胞死亡和炎症反应的发生［49］。

4 铁死亡在肝癌药物治疗中的作用

4.1 索拉非尼自2007年临床应用抗癌药物索拉非尼以来，中晚期肝癌的系统治疗发生了巨大变化，使得中晚期肝癌患者的生存期在一定程度上得到了延长。索拉非尼诱导铁死亡的机制主要有2种：一是索拉非尼抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运体介导的胱氨酸输入，导致内质网应激、GSH的消耗和铁依赖性的脂质ROS的积累［50］；二是与p62-Keapl-Nrf2通路相关，Nrf2是一种决定铁蛋白酶靶向治疗肝癌疗效的关键因子，在索拉非尼和erastin的作用下，底物p62蛋白可抑制Nrf2的降解，并使keapt失活，进而导致Nrf2的积累［51］。在给予索拉非尼治疗后，肝癌细胞中MT-1G的表达显著上调。MT-1G通过阻断GSH耗竭介导的脂质过氧化来抑制铁死亡，这一过程可促进肝癌细胞对索拉非尼的耐药性［43］。总之，Nrf2通过调节铁代谢的基因、参与氧化还原来抵抗索拉非尼诱导的铁死亡。由上述机制发现，erastin和索拉非尼的联合可能是一种有前景的癌症治疗策略，特别是在索拉非尼耐药的情况下。此外，Nrf2和MT-1G可抑制索拉非尼诱导的铁死亡，增加肝癌细胞对索拉非尼的耐药性［22］，而下调Nrf2和MT-1G的表达可为改善索拉非尼的耐药性提供一种有希望的策略。与之相反，氟哌啶醇可促进索拉非尼诱导的铁死亡，从而为索拉非尼治疗肝癌提供了一种新的策略。

4.2 对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）APAP诱导的细胞死亡的特征是GSH耗竭和GPX抑制，这个过程与caspase无关，而与铁死亡的过程高度相似。APAP的高活性代谢物为NAPQI［52］。LÖRINCZ等［53］研究表明，NAPQI可与GSH迅速发生反应，使肝细胞发生脂质过氧化，肝细胞内大量铁沉积，并导致广泛的GSH耗竭，增加肝脏损伤。但因为HepG2细胞不表达I期酶，导致APAP不能形成活性代谢物NAPQI，所以APAP对肝癌细胞系HepG2无作用。有研究表明，下调前列腺素内过氧化物酶基因2 mRNA水平，上调GPX4和轻链亚基（SLC7A11）水平来抑制铁死亡可保护肝脏免受APAP引起的损伤［54］。

4.3 柳氮磺吡啶（sulfasalazine，SZZ）SZZ是一种偶氮桥联抗炎药，对炎症性肠病（克罗恩病）、类风湿关节炎等慢性炎症性疾病有显著疗效［56-57］。硫柳氮是胱氨酸/谷氨酸反向转运系统的有效抑制剂，SZZ可抑制胱氨酸的吸收，从而导致GSH的衰减，进而产生大量的过氧化氢磷脂，导致癌症细胞发生铁死亡［58］。与erastin相比，SZZ诱导铁死亡的作用要弱得多［59］。研究发现，SZZ在胃肠道肿瘤、胰腺癌、头颈部肿瘤的治疗中有一定的作用［60］。GUO等［61］报道，SZZ可通过自噬抑制肝癌细胞SK-Hep-1和Huh-7的增殖，但其通过铁死亡诱导肝癌细胞死亡的机制有待进一步研究。

4.4 双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DAT）青蒿素是一种用特殊的过氧化物桥从传统的中草药黄花蒿中提取的内过氧化物倍半萜内酯，对全世界的抗疟治疗做出了重要贡献［62］。DAT是青蒿素衍生物的主要活性代谢物，具有较高的水溶性［63］，可以通过溶酶体依赖增强癌细胞对半胱氨酸缺失和GPX4抑制所引起的铁死亡的敏感性，且DAT可以通过铁蛋白调节和铁反应元件信号通路调控细胞的铁稳态［64］，促进半胱氨酸剥夺和GPX4抑制，增敏细胞的铁死亡［65］。CHEN等［66］研究发现，青蒿素与转铁蛋白的结合增强了其对癌细胞的选择性和细胞毒性。李艳纯等［67］研究发现，在加入DTA后，肝癌细胞株内ROS、脂质过氧化物水平增加，还原型GSH水平和GPX4水平降低，而铁抑制剂可恢复这些变化，证明DAT可通过诱发细胞铁死亡来抑制肝癌细胞的增殖。有研究发现，DAT与索拉非尼联合可通过上调MYH11的表达来影响肝癌细胞（MYH11的表达下调可能与预后差的癌症相关）［68-69］。

5 总结

肝脏是储存铁、代谢铁的主要脏器，铁代谢在肝脏疾病发病过程中发挥作用，早期发现和纠正铁超载可能有助于肝脏疾病的临床治疗。而诱发肝癌细胞铁死亡，可能会减缓肝癌进展、减少索拉非尼治疗的耐药性，但对于正常肝细胞将会导致肝损伤加重，因此，如何利用好铁死亡进行靶向治疗尚需进一步探索。LDL-DHA可以诱发铁死亡，而ACSL4、MT-1G可以监测铁死亡，所以通过铁死亡监测肝癌发展并诊断肝癌是一个新的导向。目前，对铁死亡的研究还处于起步阶段，铁死亡在肝癌进展中的诱导机制与信号通路尚需进一步研究。