外泌体的形成、功能及应用研究进展

梁春艳，邢海洲

（1.郑州大学第一附属医院血液科，河南 郑州 450000；2.郑州大学医学科学院，河南 郑州 450000）

外泌体是细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的纳米级囊泡状物质，直径30～200 nm，内含丰富的蛋白质、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、脂质等生物活性物质，广泛分布于血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁、胆汁等各种体液中，通过作用于靶细胞在细胞间信号转导和信息传递中发挥重要作用［1］。人体几乎所有细胞可产生外泌体，外泌体通过不同方式作用于多种细胞，不仅维持正常的生理过程，而且在疾病发生、发展中具有重要作用。因此，外泌体成为生物医学领域研究的重点、热点以及难点，关于外泌体的研究目前主要集中在外泌体的分离方法、内含生物活性物质的功能及其在疾病进展和治疗中的作用等方面。本文将主要从外泌体的组成成分、形成及调控机制、纯化鉴定方法、与靶细胞的作用机制、主要功能及应用等方面进行综述，以提高对外泌体的认识。

1 外泌体的组成成分

外泌体作为细胞来源的囊泡状物质，同亲代细胞一样含有丰富的核苷酸、脂类物质以及蛋白质。外泌体内含物处于动态变化中，不仅与细胞来源有关，还与细胞状态有关。外泌体中的核苷酸包括微RNA（microRNA，miRNA）、干扰小 RNA（small interfering RNA，siRNA）、信使RNA（message RNA，mRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）、转运RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）以及DNA［2］。脂质小分子物质包括胆固醇、鞘磷脂、二磷酸甘油酸、磷脂酰丝氨酸、糖脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、神经酰胺等［3］。外泌体中的蛋白质有2种：一种具有普遍性，另一种具有细胞特异性。普遍存在的蛋白质包括［2］：与信号转导相关的蛋白质，如黏附分子（整合素、选择素）、膜联蛋白、四跨膜蛋白家族（CD9、CD63、CD81、CD82）、蛋白激酶和异源三聚体G蛋白；与细胞骨架有关的蛋白质，如肌动蛋白、肌球蛋白、埃兹蛋白、微管蛋白、微丝结合蛋等；与膜转运和融合有关的蛋白质，如凋亡相关基因-2受体蛋白X（apoptosis-linked gene-2-interacting protein X，Alix）、网格蛋白、肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、囊泡分选蛋白（vacuolar protein sorting，Vps）、肝细胞生长因子调控的酪氨酸激酶底物（hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate，Hrs）、Ras结合蛋白（Ras binding protein，Rab）；分子伴侣热休克蛋白（heat shock protein，HSP）和代谢有关酶，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷脂酶D2、过氧化物酶和丙酮酸盐激酶。具有细胞特异性的蛋白与外泌体的细胞来源有关［4］，如树突状细胞（dendritic cells，DCs）来源的外泌体含有主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类分子、MHCⅡ类分子与共刺激分子CD80、CD86等，T细胞来源的外泌体携带特异性的CD3+分子、T细胞表面受体（T cell receptor，TCR），CD8+T细胞来源的外泌体中富含穿孔素和颗粒酶等，B细胞来源的外泌体携带特异性B细胞表面受体（B cell receptor，BCR），血小板来源的外泌体含有凝血因子、血友病因子和整合蛋白CD41a，神经元来源的外泌体含有谷氨酸受体，肠上皮细胞来源的外泌体含有各种代谢酶，肿瘤来源的外泌体中通常含有肿瘤抗原、Fas及转化生长因子β-（transforming growth factor-β，TGF-β）等［5］。

2 外泌体的形成及调控机制

目前认为外泌体的产生涉及2种途径：转运所需的内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）依赖途径和ESCRT非依赖途径，具体包括起始、内吞、多泡体形成、分泌4个过 程［6］。ESCRT 由 ESCRT-0（Hrs）、ESCRT-Ⅰ（TSG101、Vps28、Vps37）、ESCRT-Ⅱ（Vps22、Vps36、Vps25）、ESCRT-Ⅲ（Alix、Vps2）4个复合物组成［7］。ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-Ⅱ复合物可识别体内泛素化蛋白，ESCRT-Ⅲ复合物可调控膜的出芽和囊泡的分离。ESCRT依赖性途径具体机制：细胞膜内陷形成早期内体，经酸化形成晚期内体，晚期内体进一步形成多囊泡体（multivesicular endosomes，MVBs），MVBs的特征是存在腔内小泡，MVBs的去向与其胆固醇的含量有关，胆固醇含量较高的MVBs与细胞质膜融合，释放到细胞外基质而形成外泌体，胆固醇含量少的MVBs经溶酶体途径降解［6］。产生外泌体的ESCRT非依赖途径主要涉及神经酰胺［8］。神经酰胺可以诱导腔内小泡的形成，促进富含蛋白质、RNA和脂筏等生物分子进入腔内小泡，促进腔内小泡与细胞膜融合释放外泌体［9］。

目前认为外泌体的形成主要通过ESCRT依赖途径，其调控机制包括：（1）微管蛋白、肌动蛋白、可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）、鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）等对MVBs转运以及融合的调控［6］。Rab蛋白属于小分子GTPase，在囊泡运输过程中具有重要作用，如Rab11可以促进外泌体的产生，Rab27a和Rab27b的功能缺失可导致外泌体分泌减少［10］。（2）物理、化学、生物因素的调控作用。如提高细胞内钙离子浓度可以促进外泌体的分泌［11］。有研究发现，γ射线可激活TP53基因，与TP53野生型相比，TP53基因突变的肿瘤细胞可以分泌更多的外泌体［12］。此外，低氧情况下通过诱导缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的产生促进外泌体的分泌［13］。LOGOZZI等［14］研究发现，酸性（pH=6.5）环境下可显著增加外泌体的释放量。（3）蛋白质对外泌体产生的调控［15］。如肝素酶不仅可促进外泌体的分泌，也可改变外泌体的蛋白成分；鞘磷脂酶不仅参与囊泡的胞内运输，还可提高神经酰胺水平，促进外泌体释放。（4）ESCRT可以引导特定的分子进入MVBs，从而保障外泌体的分泌。有研究发现，ESCRT的缺失不仅可造成外泌体蛋白成分的改变，还可减少外泌体的分泌［6］。

虽然外泌体含有与亲代细胞类似的生物学成分，但外泌体中miRNA的含量较亲代细胞高，说明miRNA进入外泌体是一个精细的调控过程［16］。目前认为其相关调控机制包括以下几种：（1）中性鞘磷脂酶2（neural sphingomyelinase 2，nSMase2）依赖途径。nSMase2是第1个被报道的与miRNA进入外泌体有关的分子［17］。nSMase2通过影响神经酰胺的产生进而调节外泌体的分泌，nSMase2的过表达可增加外泌体中miRNA含量，应用nSMase2抑制剂后外泌体中miRNA含量明显减低。（2）miRNA模体（miRNA motifs）和不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）依赖途径。hnRNPA2B1可通过识别miRNA的3′端GGAC序列促进miRNA进入外泌体［18］。（3）miRNA序列3′末端依赖途径。KOPPERS-LALTC等［19］研究发现，3′末端尿苷化的内源性miRNA主要存在于尿液来源的外泌体，3′末端腺苷化的内源性miRNA主要存在于B细胞，miRNA的3′末端可能通过分选机制促进不同的miRNA进入外泌体。（4）miRNA诱导沉默复合物（miRNA induced silencing complex，miRISC）相关途径［20-21］。miRISC是成熟的miRNA与蛋白相互作用形成的复合物，包含miRNA、miRNA作用的RNA以及蛋白。GIBBINGS等［20］研究发现，外泌体形成过程中的MVBs含有大量miRISC中的GW182和阿尔古蛋白（argonaute 2，AGO2），GW182和AGO2可调节miRNA进入外泌体的过程。但目前关于miRNA进入外泌体具体的机制仍不清楚，需要进一步研究。

3 外泌体与靶细胞的作用机制

外泌体释放后广泛分布于血液、唾液、尿液、乳汁及脑脊液中，甚至分布于肿瘤患者的腹水、胸水中。外泌体不仅可以与临近细胞相结合，还可以进入远处细胞［22］。外泌体成为目前研究热点的原因之一就在于外泌体可以进入靶细胞，将蛋白质、RNA等生物活性物质传递至靶细胞，影响靶细胞的基因表达以及蛋白合成等过程，最终对靶细胞生物学活性产生影响，调节靶细胞的状态及功能。研究外泌体对靶细胞的作用，首先应明确外泌体如何与靶细胞相互作用，目前认为外泌体与靶细胞的相互作用机制有以下几种［23-24］：（1）外泌体表面蛋白直接与靶细胞受体结合，刺激靶细胞中信号通路；（2）外泌体与靶细胞膜融合，将功能性蛋白、miRNA等生物分子传递至靶细胞，外泌体mRNA可以在靶细胞中翻译出相应的蛋白质，miRNA、siRNA通过影响靶基因的表达而调控靶细胞；（3）靶细胞通过胞吞作用吞噬外泌体，而外泌体可在靶细胞内重新被释放或经溶酶体途径降解。

4 外泌体的分离纯化及鉴定技术

外泌体的分离纯化方法较多，各有优缺点，目前尚没有哪种方法既可以保证外泌体的含量，又可以保证其纯度及生物活性。目前，外泌体的分离纯化方法包括离心法、超滤法、沉淀法、免疫法等［15，25］。离心法是最常用的方法，包括差速超速离心法和密度梯度离心法。差速超速离心法是最经典也是使用最多的外泌体提取方法，具有成本低、获得率高等优势，但是耗时、容易被污染，而且超高速离心可能破坏外泌体结构。密度梯度离心法与差速超速离心法相比，其获得的外泌体纯度较高，但同样具有耗时、会破坏外泌体结构等缺点。超滤法也是公认的外泌体提取方法，具有快速、高效等优点，但在超滤过程中可能损失大量外泌体。商用外泌体分离纯化试剂盒因操作简单、节省时间而受到越来越多的关注，大多商用试剂盒使用聚合物共沉淀方法富集外泌体，但商用试剂盒分离出的外泌体纯度较低。免疫亲和法利用包被单克隆抗体的磁珠结合外泌体，可用于外泌体某一亚群的提取，特异性较高，但成本高、产出少，且不适用于大量样本。此外还有色谱法、尺寸排除色谱法、场流分馏、微流体过滤法、无接触分选等方法也可以用于外泌体的分离纯化。

外泌体分离纯化后主要从3个方面进行鉴定［25-26］：（1）外泌体形态。多采用扫描电镜或是透射电镜进行外泌体形态鉴定。外泌体直径30～200 nm，呈“茶杯样”。（2）外泌体大小及浓度。多采用纳米粒子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）检测外泌体大小及浓度。（3）外泌体标志蛋白。多采用Western blot法检测标志性蛋白，如外泌体表面蛋白（四次跨膜蛋白家族CD9、CD63及CD81），外泌体内含蛋白（HSP90及HSP70等），外泌体合成相关蛋白Alix及Tsg101等。

5 外泌体的功能

外泌体的功能不仅与其细胞来源密切相关，还与其所含蛋白质、RNA种类有关，不同来源的外泌体在不同的生理、病理阶段具有不同的功能。

5.1 清除作用最初认为外泌体是细胞排除废弃物的一种方式。JOHNSTONE等［27］首先在绵羊网织红细胞体外培养中发现外泌体的存在，认为网织红细胞通过这种机制清除细胞内不需要的蛋白质及其他生物学分子。

5.2 维持正常生理过程外泌体可以调控靶细胞生理活动，维持细胞内稳态。另外，外泌体也可以维持机体免疫耐受，如活化的T细胞可招募DCs来源的外泌体，防止T细胞的过度活化［28］；DCs来源的外泌体可以诱导T细胞免疫应答，调节T细胞分化，参与机体免疫应答［29-31］。在机体发育过程中，外泌体中的Wnt调节细胞分化。同时外泌体通过磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信号通路、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路、细胞外信号调节激酶/基质金属蛋白酶9（extracellular signal-regulated kinase/matrix metallopeptidase 9，ERK/MMP-9）信号通路等多种途径调控细胞凋亡［32-34］。

5.3 介导病理过程外泌体不仅可以维持正常生理过程，也参与病理过程，这也是外泌体成为研究热点的主要原因之一。外泌体几乎参与所有疾病过程，如感染性疾病、肿瘤、移植耐受、自身免疫性疾病、代谢性疾病等，其中外泌体在肿瘤发生发展中的作用受到广泛关注。肿瘤细胞可以分泌大量的外泌体，肿瘤细胞来源的外泌体的含量远远高于非肿瘤细胞。肿瘤细胞来源的外泌体内含有肿瘤抗原、miRNA、mRNA等多种生物活性物质，在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移中发挥重要作用［35-36］。一方面，外泌体内的蛋白质、RNA等通过决定肿瘤转移方向、传递肿瘤转移信号、促进肿瘤迁移、诱导上皮间质转化、促进新生血管形成、建立转移前微环境和传染转移等机制促进肿瘤的生长及转移［37-38］。MAJI等［39］研究发现，高表达膜联蛋白（annexinⅡ）的外泌体可促进肿瘤微环境中血管生成以及乳腺癌转移；HOSHINO等［40］研究发现，外泌体内的整合素α6β4和α6β1于促进肺转移，αvβ5可促进肝转移；ZOMER等［41］研究发现，侵袭性较强的肿瘤细胞来源的外泌体可以增加恶性程度较低肿瘤细胞的侵袭性；FONG等［42］研究发现，肿瘤细胞来源的外泌体miR-122可以抑制非肿瘤细胞对葡萄糖的摄取，为肿瘤细胞转移提供微环境。另一方面，肿瘤细胞来源的外泌体可以通过上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-3和caspase-9的表达，激活线粒体依赖的凋亡通路，诱导肿瘤细胞的凋亡［43］。肿瘤细胞来源的外泌体不仅在肿瘤生长、转移过程中具有双重性，在肿瘤免疫反应中同样具有两面性：一方面，肿瘤细胞来源的外泌体携带有肿瘤抗原，这些肿瘤抗原可被DCs摄取，引发CD8+T细胞依赖的抗肿瘤免疫效应［44］；另一方面，肿瘤细胞来源的外泌体在肿瘤逃逸中发挥重要作用。肿瘤细胞来源的外泌体可以抑制T细胞增殖、诱导T细胞凋亡，促进T细胞向调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）分化，抑制自然杀伤（natural killer，NK）细胞介导的细胞毒作用以及DCs的分化和成熟，促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化以及促进髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的产生［4］。STENQVIST等［45］研究发现，肿瘤细胞来源的外泌体中自杀相关因子配体（factor-associated suicide ligand，FasL）可以与活化的免疫细胞表面的自杀相关因子（factor-associated suicide，Fas）结合，抑制免疫细胞功能，促进免疫细胞凋亡。LUNDHOLM等［46］研究发现，前列腺癌细胞来源的外泌体中自然杀伤细胞活化性受体（natural killer group 2 member D，NKG2D）的配体可以选择性下调NK 细胞以及CD8+T细胞表面NKG2D的表达，抑制NK细胞以及CD8+T细胞的杀伤作用，抑制肿瘤免疫功能。

6 外泌体的应用

6.1 新型标志物作用外泌体在肿瘤相关疾病的研究中，首先关注的是外泌体可以作为肿瘤诊断的新型标志物［47］。肿瘤细胞可以分泌大量外泌体，其中蛋白质、miRNA甚至DNA可以作为非侵入性诊断的肿瘤标志物［48］。TAYLOR等［49］首次提出了肿瘤患者血清来源的外泌体中miRNA（miR-21、miR-141、miR-200等）可以作为卵巢癌诊断的肿瘤标志物。YANG等［50］研究认为，外泌体中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM）、黏蛋白1（mucin 1，MUC1）、磷脂酰肌醇聚糖1（glypican，GPC1）、Wnt2等可以用于胰腺导管腺癌的诊断以及预后判断。WANG 等［51］认为，miR-125a-3p可以作为早期结直肠癌的诊断标志物。外泌体中的一些miRNA和蛋白质作为卵巢癌、肺癌、肝癌、白血病等多种肿瘤的新型标志物，不仅可以判断肿瘤的大小、恶性程度、侵袭转移、分期分级等，也可用于肿瘤疗效及预后评估［48，52-55］

6.2 治疗作用因为外泌体在肿瘤发生、发展、转移中具有重要作用，所以其可以被用于肿瘤的治疗［56］。通过抑制外泌体的产生或者体外滤过外泌体可以抑制肿瘤的进展。BOBRIE等［57］研究表明，特异性敲低Rab27b后肿瘤细胞分泌外泌体明显减少，且小鼠乳腺癌细胞的转移得到抑制。外泌体中某些蛋白质、RNA通过抑制机体抗肿瘤免疫来促进肿瘤细胞的侵袭、转移，因此，特异性抑制这些生物活性物质的产生可以提高抗肿瘤免疫，抑制肿瘤进展。RONG等［58］研究发现，肿瘤细胞外泌体中TGF-β通过抑制T细胞增殖，促进免疫逃逸，而特异性抑制外泌体TGF-β表达后可增强T细胞活性，抑制肿瘤转移。另外，外泌体中的特定miRNA可以促进肿瘤耐药，而抑制miRNA表达可以增强肿瘤细胞对化学治疗药物的敏感性，促进化学治疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。外泌体中miR-222的高表达与乳腺癌细胞耐药有关，特异性抑制miR-222后可以增加乳腺癌细胞对他莫西芬的敏感性［59］。外泌体还可以激活线粒体依赖的凋亡通路，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的发生发展［60］。因此，外泌体在肿瘤治疗中发挥着重要的作用，具有良好的应用前景。

6.3 载体作用外泌体作为细胞来源物质，是天然的载体。其磷脂双分子层结构对蛋白质、miRNA等生物学活性物质具有良好的保护作用，因此，外泌体中的蛋白质、RNA具有较高的稳定性［61］。外泌体与亲代细胞具有相似的生物学活性，在体内广泛分布并长期存在，具有半衰期长、天然无毒等优势［62］。外泌体的直径较小，属于纳米级结构，可以逃避吞噬细胞吞噬作用，同时自由穿梭于细胞与细胞以及细胞与基质间，具有穿透能力强、低免疫原性等特性［63］。外泌体内含mRNA、miRNA、非编码RNA和蛋白质，在基因治疗中，能够同时载入生物大分子、短肽和小分子药物等［16］，具有较强的装载能力。因此，外泌体可以通过装载药物、miRNA等应用于肿瘤治疗。另外，肿瘤细胞来源的外泌体还可用于肿瘤疫苗的研发［64-65］。

7 外泌体在应用中存在的问题

虽然外泌体具有良好的研究价值和应用价值，但是在外泌体的研究中仍然存在一些问题。目前研究应用的肿瘤患者的血清外泌体包含正常细胞来源以及肿瘤细胞来源的外泌体，需要寻找一种方法把肿瘤细胞来源的外泌体与正常细胞来源的外泌体进行分离。有学者应用免疫亲和捕获的方法获取CD34+来源于白血病细胞的外泌体［66］，但是正常细胞在肿瘤细胞的影响下也可造成外泌体成分的改变，而这些改变的成分很可能是肿瘤标志物，因此应用免疫亲和方法获取的外泌体是可作为肿瘤标志物来源这一问题仍未得到解决。另一个问题是冷冻、储存的血液样本是否可以代替新鲜采集的血液样本，虽然核酸的研究不受冷冻的影响，但外泌体的完整性以及蛋白质很可能受解冻的影响［65］。此外，虽然外泌体在体内含量较高，样本较易获取，但其分离纯化过程较复杂，不能保证所获取的外泌体的纯度以及含量。虽然体内多种细胞可以分泌外泌体，但并不是所有外泌体都可以作为载体，因此需要寻求一种经刺激后可以分泌大量可作为载体的外泌体的细胞系。肿瘤细胞可以分泌大量外泌体，但肿瘤细胞携带肿瘤相关抗原，其分泌的外泌体是否可以用于肿瘤的治疗需要进一步研究。目前，将药物以及小分子物质转入外泌体内的方法主要包括共孵育、化学转染、电转染等方法，这些方法各有优缺点，且不能保证转染效率，需要寻求一种高效稳定的转染方法。另外，是通过静脉注射、瘤内注射还是口服使外泌体进入体内目前尚无统一的标准，外泌体应用次数以及用量也无统一的标准。这些问题的解决均需要在临床试验中进一步研究。

8 结语

外泌体富含蛋白质、核酸等生物活性物质，在细胞间交流中发挥着重要的作用，在肿瘤诊断、治疗中具有重要的意义，是目前研究的热点。但目前尚无一种技术在外泌体的分离纯化中既可以保证数量也可以保证纯度和生物学活性，因此，需要找寻一种新技术用于外泌体的分离纯化。目前外泌体的鉴别主要从形态、大小、标志物等方面进行，需要探索一种具有高敏感性和高特异性的检测技术对外泌体进行检测。对外泌体的鉴定也无统一的标准，仍需要探索外泌体鉴定的“金标准”。外泌体形成的过程中，如何对进入的物质进行筛选，以及影响外泌体分泌的因素有哪些，具体的机制是什么仍需要进一步研究。外泌体如何作用于靶细胞，通过何种方式对靶细胞进行调控，具体的机制如何也需探索。外泌体可以介导肿瘤的发生、发展及转移，但其对肿瘤发生的促进作用具体表现在哪些方面，如何介导抗肿瘤免疫的发生以及肿瘤的免疫逃逸等问题仍需进一步研究；外泌体在肿瘤治疗方面的研究仍处于实验阶段，进入临床阶段要克服的问题又有哪些，还需要认真思考和研究。总之，外泌体是目前生物医学领域研究的重点热点，但目前对其研究深度不够，需要生物医学工作者们投入更多的人力、物力进行相关的研究。