规律成簇间隔短回文重复-相关核酸内切酶9技术在基因组编辑和基因转录调控中的应用

管丽红，贾紫森，林俊堂，3

（1.新乡医学院生命科学技术学院，河南省干细胞医学国际联合实验室，河南省干细胞与生物治疗技术研究中心，河南 新乡 453003；2.河南省医用组织再生重点实验室，河南 新乡 453003；3.新乡医学院医学工程学院，河南新乡 453003）

规律成簇间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）及CRISPR 相关核酸内切酶（CRISPR associated protein，Cas）系统是古生菌和细菌中发现的一类获得性免疫系统，该系统能够从初次入侵的外源DNA中获得一小段序列；当同样的外源DNA再次入侵时，该系统即可转录出相应的RNA，从而识别并引导Cas蛋白切割外源DNA，导致外源DNA最终被降解［1］。科学家们基于CRISPR-Cas系统识别和切割DNA的功能，将CRISPR-Cas9系统发展为一种由RNA指导核酸内切酶的基因编辑技术［2］。CRISPRCas9技术通过一段长度为20 nt的单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）序列引导Cas9蛋白对目标DNA进行切割，造成双链DNA的断裂，从而诱发细胞内的同源重组修复或非同源末端连接修复，利用细胞的自身修复机制对DNA进行修复，最终导致目标DNA的缺失或插入突变［3-4］。这一技术以其简单、高效、成本低等优势获得科学家的青睐，迅速被用于不同物种的基因组编辑。本文主要阐述CRISPR-Cas9技术在基因组编辑和基因转录调控中的应用。

1 CRISPR-Cas9技术在基因组编辑中的应用

2012年，JINEK等［5］研究发现，将CRISPR RNA（crRNA）与反式激活crRNA融合为一个嵌合体RNA后，能够指导Cas9切割双链DNA。随后，sgRNA引导的CRISPR-Cas9技术被广泛用于细菌、昆虫、植物和动物的基因功能研究［6-9］。下面就CRISPR-Cas9技术在动物细胞和体内基因敲除及基因治疗中的应用进行介绍。

1.1 CRISPR-Cas9技术在基因敲除中的应用CRISPR-Cas9最常用于构建基因敲除细胞系和动物模型。2013年，HWANG等［10］利用CRISPR-Cas9技术成功敲除斑马鱼的细胞毒性颗粒相关RNA结合蛋白1和糖原合成酶激酶-3β基因，证明该技术与锌指核酸酶和转录激活效应因子核酸酶技术一样可以有效编辑斑马鱼的基因组。同年，NAKAYAMA等［11］利用CRISPR-Cas9技术成功敲除热带爪蟾的酪氨酸酶（tyrosinase，tyr）基因，导致其眼睛出现白化病表型，这一研究为热带爪蟾的基因功能研究提供了有效技术。LI等［12］利用2个sgRNA引导Cas9成功敲除小鼠的泛素样植物同源和环指结构域（ubiquitin like with PHD and ring finger domains 2，Uhrf2）基因，此外，该研究将Casq mRNA和2个sgRNA共注射到大鼠一细胞期胚胎中，同时敲除肾上腺皮质3受体（melanocortin 3 rceptor，Mc3R）和肾上腺皮质4受体（melanocortin 4 receptor，Mc4R）基因，证明CRISPR-Cas9技术可用于多基因功能缺失的研究。2014年，NIU等［13］利用CRISPR-Cas9技术成功编辑了食蟹猕猴的过氧化物酶体增殖体激活受体γ基因和重组激活基因1，证明该技术能够在灵长类动物中得到应用。2015年，LIANG等［14］利用CRISPR-Cas9技术编辑了人的三原核受精卵的β球蛋白基因，这是将CRISPR-Cas9技术首次应用到人类胚胎的研究，但这一研究引起了国内外学者关于伦理的争论。2016年，SHINMYO 等［15］利用CIRSPR-Cas9技术联合子宫内电转基因技术成功敲除胚胎期小鼠脑内特异的富含AT序列结合蛋白2（special AT-rich sequence binding protein 2，Satb2）基因，导致小鼠大脑皮层中Satb2表达量明显下降，证明CIRSPR-Cas9技术可以用于编辑神经细胞。2017年，GANDHI等［16］利用CIRSPR-Cas9技术联合电转基因技术成功敲除了在神经嵴发育过程中发挥重要作用的转录因子配对盒7和性别决定区域Y-框10基因，使其在早期鸡胚发育中失去了功能，说明CIRSPR-Cas9技术在鸡胚靶向基因敲除中有较好的应用价值。2018年，ROH 等［17］分别将靶向瘦素（leptin，Lep）和瘦素受体（leptin receptor，Lepr）基因的sgRNA和Cas9 mRNA共注射入小鼠受精卵中，获得了Lep和Lepr基因敲除的小鼠模型，其表现出与肥胖（ob/ob）和糖尿病（db/db）小鼠相似的体质量增加、高血糖和脂肪肝等，证实CIRSPR-Cas9技术可用于肥胖和糖尿病的研究。2019年，RASYS等［18］利用CIRSPR-Cas9技术联合显微注射技术将Cas9蛋白和3个靶向tyr基因的sgRNA同时转入安乐蜥的未成熟卵母细胞中，最终获得了白化病表型的安乐蜥模型，这一研究填补了CIRSPR-Cas9技术在爬行类动物研究中应用的空白。2020年，BYAMBAA等［19］将靶向白细胞介素-2受体γ链基因的sgRNA和Cas9 mRNA共注射到小鼠受精卵中，成功获得了X连锁严重联合免疫缺陷症（X-linked severe combined immunodeficiency，X-SCID）模型，为X-SCID基因编辑治疗的评估提供了有价值的动物模型。

1.2 CRISPR-Cas9技术在基因治疗中的应用CRISPR-Cas9最具前景的应用是对于疾病的基因治疗。2013年，WU等［20］利用CRISPR-Cas9技术修复了白内障小鼠受精卵的晶状体γC基因突变，并且可以稳定地遗传给后代。2014年，YIN等［21］靶向I型酪氨酸血症小鼠的Fah基因突变，通过尾静脉注射的方式将连接有特异sgRNA和Cas9的pX330载体和单链寡核苷酸（single-stranded DNA，ssDNA）注射入小鼠体内，获得了正常表型的小鼠。2015年，SCHUMANN等［22］利用CRISPR-Cas9技术编辑人类原代T细胞的趋化因子受体（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）基因，导致CXCR4蛋白的表达降低。CXCR4是人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的入侵受体，其表达量降低可抑制HIV的入侵，因此，这一研究为HIV感染的治疗提供了新的方法。2016年，YANG等［23］通过静脉注射2个腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体（1个AAV 载体携带sgRNA 和供体DNA，另1个AAV载体携带Cas9）修复了高血氨症新生小鼠约10%的肝细胞中鸟氨酸转氨甲酰酶基因突变，并延长了小鼠的寿命。同年，GUAN等［24］构建了凝血因子9（coagulation factor IX，F9）基因Y371D突变的血友病B小鼠模型，分别利用裸DNA载体和腺病毒（adenovirus，AdV）载体介导的CRISPR-Cas9技术修复其基因突变，其中，接受裸DNA载体的小鼠，肝细胞中F9基因的校正率超过0.56%，能够恢复止血作用；而AdV传递系统虽然能够纠正基因突变，但由于可导致严重的肝毒性而达不到治疗效果。2017年，KOLLI等［25］利用CRISPR-Cas9技术在亨廷顿舞蹈症（Huntington′s disease，HD）YAC128小鼠的骨髓间充质干细胞中成功沉默了突变的亨廷顿（huntingtin，HTT）基因；YANG等［26］利用CRISPR-Cas9技术在HD140Q敲入小鼠模型中永久地抑制了突变HTT基因的功能，从而改善了HD 小鼠的神经毒性。2018年，GYÖRGY等［27］利用AAV将靶向导致阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的瑞典突变（APPswe）基因的sgRNA和Cas9分别转入从APPSW转基因小鼠（Tg2576）胚胎分离的原代神经元和成年小鼠海马区，结果显示，其能降低致病的β-淀粉样蛋白的表达。2019年，EKMAN等［28］应用AAV将靶向HTT突变基因的sgRNA和Cas9转入HD R6/2小鼠纹状体区域，使HTT突变蛋白在神经元中的表达降低了约50%，并且延长了小鼠的寿命，改善了小鼠的运动障碍。2020年，PINZON-ARTEAGA等［29］设计了靶向导致糖原分支酶缺乏的糖原分支酶1（glycogen branching enzyme 1，GBE1）基因C＞A突变位点的sgRNA，并连接到pX458载体上，将其与ssDNA共转染至原代马成纤维细胞中进行了基因修复，修复效率达20%。这些突破性研究为一些难治性疾病的治疗带来了新的希望。

2 CRISPR-Cas9技术在基因转录调控中的应用

CRISPR-Cas9不仅可以从基因组水平编辑基因，也可以对特定的转录序列进行抑制或激活。2013年，QI等［30］将D10A和H840A 2个突变位点分别引入化脓性链球菌Cas9（SpCas9）的RuvC和HNH 2个切割域，导致Cas9蛋白不能行使切割DNA的功能，但仍保留与DNA结合的能力，这种失去核酸内切酶活性的Cas9蛋白被称为死亡Cas9（dead Cas9，dCas9）。因此，科学家们利用dCas9结合DNA序列的能力，发展出能够抑制基因表达的CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）技术和激活基因表达的CRISPR激活（CRISPR activation，CRISPRa）技术［31］。

2.1 CRISPRi的转录抑制作用当dCas9与靶基因的阅读框结合时，能够阻断RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）的延伸；当dCas9结合到靶基因的启动子或转录起始位点（transcriptional start sites，TSSs），可阻止基因转录的起始。2013年，BIKARD等［32］靶向绿色荧光蛋白（green fluorescent proteins，GFP）报告质粒的开放阅读框和启动子，设计了22个不同的crRNAs，该研究结果显示，不同的crRNA均能诱导dCas9抑制GFP的表达，导致该质粒在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达GFP的强度下降。2014年，ZHAO等［33］利用CRISPRi技术成功抑制了小鼠胚胎成纤维细胞 NIH3T3 中微 RNA（micro RNA，miR）-21和miR-30a的表达，证明该技术可用于miRNAs的转录调控。2015年，SUN等［34］利用CRISPRi技术在造血特异性miR-142缺陷T细胞中沉默非典型E2F转录因子E2f7和E2f8，改善了细胞周期缺陷并降低了移植物抗宿主病（graftversus-host disease，GVHD）发生率，这一研究为GVHD提供了潜在的治疗策略。2016年，HEMAN-ACKAH等［35］将dCas9与转录抑制子KRAB融合，利用sgRNA靶向帕金森病（Parkinson′s disease，PD）致病基因α-突触核蛋白（synuclein，SNCA）基因的TSSs，使由SNCA三倍化引起的PD患者中诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）分化的神经元中SNCA表达量明显降低。2017年，LIU等［36］应用CRISPRi技术在不同细胞系中成功抑制了长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）的表达，证实该技术可用于lncRNAs的转录调控。2018年，YOSHIDA等［37］采用整合的CRISPRi技术抑制了ΔNp63的转录，有效降低了肺癌和食管鳞状细胞癌细胞的增殖和克隆，并可诱导细胞凋亡；还可显著抑制肺癌和食管鳞状细胞癌小鼠肿瘤的生长。2019年，WANG 等［38］将dCas9分别与转录抑制因子KRAB、Hairy、SID、SRDX和ERD结合，与相应的sgRNAs共转染至家蚕细胞中，均能不同程度抑制其靶基因的表达；共转染dCas9-SID、dCas9-SRDX和dCas9-ERD及相应的sgRNAs后，可在家蚕细胞中同时抑制其靶基因的表达，这一研究表明，CRISPRi技术可应用于家蚕和其他鳞翅目昆虫基因组功能研究中。2020年，HAZELBAKER等［39］建立了AAVS1介导的多西环素诱导的piggyBac（PB）转座子与dCas9-KRAB系统，能够有效抑制人类多能干细胞中皮特-霍普金斯综合征和精神分裂症相关基因TCF4的转录和表达，该研究有助于进行单个基因和通路的功能剖析及大规模对生长发育和疾病相关基因的筛查。

2.2 CRISPRa的转录激活作用当dCas9与具有转录激活功能蛋白质的功能结构域或TSSs结合时，可以激活基因的转录。2013年，MAEDER等［40］研究发现，将dCas9与转录激活子VP64融合后，在特异sgRNA的引导下，能够显著促进人胚肾细胞HEK293中血管内皮生长因子A基因和神经营养因子3基因的转录。BIKARD等［32］将dCas9与RNAP的ω亚基融合，能够提高RNAP的活性，使得GFP的表达显著上调。2014年，GAO等［41］将PB转座子系统与CRISPRa技术结合，应用sgRNA靶向增强子，激活了有机阳离子/肉碱转运蛋白4（organic cation/carnitine transporter 4，Oct4）和Nanog同源框（Nanog homeobox，Nanog）基因在小鼠胚胎成纤维细胞 中的转录。2015年，NIHONGAKI等［42］和POLSTEIN等［43］分别建立了包含2个融合蛋白和sgRNAs的基于CRISRP-Cas9的光激活转录系统，第1个融合蛋白包括dCas9和隐花色素相互作用的基本螺旋环1（cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 1，CIB1），由sgRNAs引导其靶向特异的基因组位点；第2个融合蛋白包括光敏感的隐花色素2（cryptochrome 2，CRY2）或其光裂合酶同源区（cryptochrome 2 photolyase homology region，CRY2PHR）和转录激活区。无蓝光照射时，sgRNAs引导第1个融合蛋白结合到靶基因的启动子上，而第2个融合蛋白分散在细胞核中；蓝光照射时，CRY2或CRY2PHR与CIB1形成异二聚体，随后转录激活区被招募到靶基因处，进而激活基因表达。这种光诱导的CRISPR-Cas9系统可有效地在HEK293T细胞中动态调节内源性基因的激活，可用于需要精确空间和（或）时间控制细胞行为的基础科学、合成生物学和组织工程研究中。同年，ZIETSCHE等［44］开发了一种“分裂的Cas9结构”（将Cas9分为C端和N端2个部分），通过雷帕霉素诱导可以重建功能完整的Cas9核酸酶，在HEK293FT和N2A细胞中激活相应基因的转录。2016年，HEMAN-ACKAH等［35］将dCas9与三重转录激活子VP64-p65-Rta融合，应用sgRNA靶向PD致病基因SNCA的TSSs，使健康人iPSC分化的神经元中SNCA的表达水平增加，与由三倍化引起的PD患者iPSC分化的神经元中SNCA的表达量相近。2017年，LI等［45］将PB转座子系统与CRISPRa技术结合，用于激活多个内源性转录因子和lncRNAs的转录，并证明该系统能够加速iPSCs向神经元和星形胶质细胞分化，这一研究结果预示着PB-CRISPRa系统在神经科学研究中具有潜在的应用价值。2018年，PUTRI等［46］首次将CRISPRa和光遗传学系统联合用于斑马鱼中，在斑马鱼胚胎成纤维细胞中成功激活了achaete-scute家族 bHLH 转录因子1a（achaete-scute family bHLH transcription factor 1a，ASCL1a）、B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤6a（B-cell CLL/lymphoma 6a，BCL6a）和热休克蛋白70基因的表达。2019年，MATHARU等［47］将dCas9与VP64融合后，利用CRISPRa技术分别靶向对食欲调节起关键作用的专一家族bHLH 转录因子1（single-minded family bHLH transcription factor 1，Sim1）和Mc4R基因启动子或下丘脑特异增强子，从而提高了Sim1或Mc4R基因的表达，减轻了Siml或Mc4R单倍剂量不足小鼠的肥胖程度，这些研究为CRISPRa系统用于治疗因基因剂量敏感导致的疾病提供了理论依据。2020年，COLASANTE等［48］利用多西环素诱导的CRISPRa技术增加了钾离子通道基因在颞叶癫痫模型小鼠海马兴奋性神经元中的表达，减轻了自发性全身强直阵挛性癫痫发作，并成功改善了与慢性癫痫相关的认知障碍，这一研究为基于CRISPRa的神经系统疾病治疗提供了实验依据。

3 结语与展望

尽管CRISPR-Cas9技术在基因组编辑中应用广泛，但其也存在着不可避免的缺陷，如脱靶效应［49-50］。自CRISPR-Cas9技术问世以来，科学家们一直致力于提高其特异性，例如，NAITO等［51］设计了CRISPRdirect软件，根据不同条件限制筛选特定序列的sgRNA以降低脱靶效应；SLAYMAKER等［52］通过突变Cas9的几个氨基酸位点来提高其靶向性，降低其脱靶效应；SHEN等［53］受合成生物学的启发，建立了一个合成开关，不仅在转录阶段通过sgRNA对Cas9基因进行自我调节，而且在翻译阶段通过L7Ae：K-turn抑制系统进行自我调节，限制性的Cas9表达可诱导高效的靶向插入或缺失突变，同时最小化脱靶效应。CRISPR-Cas9技术在基础研究中发挥着巨大作用，探索如何将其安全高效地运用于临床研究和基因治疗中必将对临床医学产生深远的影响。

志谢：感谢韩亚伟博士、杨慈清博士、乔梁博士和李小英老师对本文的建议与修改！