口蹄疫病毒O型抗体检测注意事项及结果分析

吕宝珍

（洛南县动物疫病预防控制中心，陕西洛南 726100）

1 样品来源

该实验样品来自于全县16个镇，随机抽取生猪养殖场20个，每场采集血清样品15份；零散养殖户随机抽取16户，每户采集血清样品5份，共计380份。

2 实验仪器

量筒、烧杯、离心管架、超纯水机、电热恒温箱、洗板机、酶标分析仪、移液枪头、单道移液器、多道移液器、离心管、一次性洗液皿、一次性吸水纸。

3 洗涤液配制

用量筒取900ml蒸溜水或去离子水与100ml洗涤液混合（洗涤液是浓缩洗液，需要稀释），充分混匀即为工作浓度洗涤液。

4 具体实验步骤

4.1 实验前的准备工作

将阻断ELISA抗体检测试剂盒和待检血清从冷藏和冷冻箱中取出，将待检血清竖行排列于离心管架上，并做好编码，等试剂和血清样品温度恢复到室温20℃～25℃，在进行实验。

4.2 操作步骤

4.2.1 加样

（1）预先取出包被板，取出样品稀释液，在每孔加入样品稀释液50 μl。

（2）再用10 μl的移液器添加50μl待检样品。

（3）在包被板最后加入50μl阴性和阳性对照品各2孔，盖膜，避光在37℃反应60min。

4.2.2 洗板

60min时间到取包被板，揭掉封板膜，倒掉孔内液体，用预先配制好的洗涤液洗涤3次，每次停留1min；最后一次倒干净后，用吸水纸将包被板内液体拍干。

4.2.3 检测

（1）在包被板中加酶标结合物（1号液）100μl，盖膜，避光在37℃反应60min。60min时间到后取出包被板，揭膜，倒掉孔内液体，用预先配制好的洗涤液洗涤3次，每次停留1min；最后一次倒干净后，用吸水纸将包被板内液体拍干。

（2）按所需要用量，临用前用单道移液器取等体积底物液（3号液）和显色液（4号液）充分混匀，每孔加入100μl，盖膜，避光37℃反应15min。

（3）15min时间到后取出反应后的酶标板，每孔用多道移液器加入终止液（6号液）50μl。用酶标仪读取OD值。

5 结果判定

（1）有效判定：当阴性对照孔OD值≥0.5（若小于0.5则实验无效），当阳性对照孔IP值≥60%（若小于60%则实验无效）。

（2）检验结果：样品PI≥50%时，判定为口蹄疫病毒抗体阳性；样品PI＜50%时，判定为口蹄疫病毒抗体阴性。

6 注意事项

（1）洗涤液的配置必须用蒸溜水或去离子水稀释，避免水质不符合要求，影响实验结果的判定。

（2）实验前所用的试剂盒和畜种血清样品都应恢复至室温时再开始做实验。

（3）洗涤液的配置应比实际需要量多配置一些，避免因试剂在各个器具上的残留而导致的洗涤液的不足，需临时加配延误时间使反应时间不同步，影响实验结果。同时还应注意洗板机的注水口注水是否通畅、吸水口吸水是否通畅，确保反应板每孔必需注满洗涤液洗涤干净。

（4）添加酶标结合物时，枪头不要碰包被板孔内壁和外壁。

（5）做实验时应做好个人防护，穿好防护服、佩戴好防护帽、手套和口罩，实验中试剂使用结束后应立即将试剂瓶盖紧，防止剩余试剂被污染，影响后续的检测；实验结束废弃物由医疗废弃物处理机构统一处理，不可以随意丢弃，以免造成环境的污染。

7 结果分析

全县有16个乡镇，244个行政村，随机抽取生猪养殖场20个，每场采集血清样品15份；零散养殖户随机抽取16户，每户采集血清样品5份，共计380份，合格340份、合格率89%。总体来看我县生畜口蹄疫病毒O型的免疫抗体水平较高，确保了我县常年处于疫苗保护状态，有效预防控制了动物疫病的发生流行，确保了全县全年动物疫情的稳定控制态势。