SLC2A9 基因rs938552 位点多态性与肾结石相关性研究

游 攀， 马 杰， 杨佳伟， 张 鹤， 徐冀东， 胡传义

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.上海市浦东新区公利医院泌尿外科，上海 200135）

肾结石是泌尿外科的一种常见疾病。人群发病率为1%～5%[1-2]。我国南方地区是世界上三大结石高发区之一[3]。葡萄糖易化转运蛋白9（SLC2A9）是调控肾小管中尿酸重吸收的重要因子。SLC2A9 基因的遗传变异与人血清尿酸水平升高有关，其基因多态性在欧洲人群中可导致高尿酸血症和泌尿系结石的发生，而欧洲人群与中国人群SLC2A9 基因型频率有很大差异[4-5]，中国人群中是否存在SLC2A9 基因多态性与肾结石的相关性，此类相关报道较少。前期的研究[6]发现SLC2A9 基因多态性与肾结石的发生密切相关，为了解SLC2A9 基因rs938552 位点多态性与肾结石形成之间的关联性，本文对SLC2A9基因rs938552 位点多态性与生化指标及结石成分的关系进行研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2017 年1 月至2018 年12 月在上海市浦东新区公利医院住院治疗的高尿酸合并肾结石患者共300 例为病例组，其中男186 例，女114例，平均年龄（41.5±11.9）岁。纳入标准：①符合2014 版泌尿外科疾病诊疗指南的诊断标准，根据临床症状、尿路平片、B 超诊断为原发性肾结石；②华东地区出生、汉族、无异族通婚史、无血缘关系；③接受住院治疗（经皮肾镜钬激光碎石取石术、输尿管软镜钬激光碎石取石术、体外冲击波碎石治疗）；④无糖尿病、冠心病、高血压病、脑梗塞、脑溢血等严重心脑血管疾病，能够耐受治疗；⑤有结石标本并行结石成分分析；⑥签署知情同意书并愿意接受相关治疗。排除标准：①患者身体条件差，无法耐受治疗；②患者文化程度低，无法理解知情同意书内容，围手术期无法配合治疗；③排除因输尿管梗阻及甲状旁腺功能亢进等因素导致的继发性结石。另选取300 例上海市浦东新区公利医院体检中心的健康人群为对照组，其中男190 例，女110 例，平均年龄（42.4±12.3）岁，病例组及对照组均为出生于华东地区的汉族人群。本研究获得浦东新区公利医院伦理委员会的审议批准及患者的书面同意。

1.2 试剂与引物

外周血DNA 分离试剂盒为BioTake 生物公司产品，PCR Master Mix 为MBI Fermentas 公司产品。SLC2A9 基因rs938552 位点的引物序列按照DNA man 程序设计，上游5'-TACTGCTGAGGG CTGAGCA-3'；下游5'-CAAGGAGGGTGGATGGA-3'，由上海美吉生物科技有限公司合成。

1.3 PCR-Sanger 测序法分析SLC2A9 基因rs938552位点的基因型

1.3.1 DNA 的提取 采集空腹外周静脉血4 mL，用外周血基因组DNA 提取试剂盒进行分离提取。1.3.2 PCR 扩增目的基因片段 SLC2A9 基因rs938552 分型反应体系总体积为20 μL，包括10 μL PCR Master Mix、上下游引物各30 pmol、0.1～0.5 μg DNA 模板。PCR 扩增条件:95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环；72 ℃延伸5 min。

1.3.3 Sanger 测序 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用ABI 3730XL 测序仪进行测序分析，由上海美吉生物科技有限公司完成。

1.4 生化检测

1.4.1 血生化检测 采集早晨空腹外周静脉血4 mL，1200 r·min-1离心15 min 后取血清，生化仪检测血清尿酸、钙、磷、钠、镁等水平。

1.4.2 24 h 尿液生化检测 留取当日晨8 点至次日晨8 点24 h 的全部尿液，混匀后精确测量并取尿液10 mL，采用高效液相色谱仪光电比色法测定尿生化指标，包括尿液pH 值、尿酸、枸橼酸、钙、磷、镁等。

1.5 结石成分分析

收集经尿路排出或手术取出的结石标本，去污、晾干，于70～100 ℃烘箱内烘干。取约1 mg 结石粉末与溴化钾按1∶200 的比例混合，研磨成粉。利用压片机将以上混合细粉制成厚度约1 mm 的薄片。将薄片放入红外光谱仪槽中扫描，绘制图谱，自动分析并报告结石成分[7]。

1.6 统计学方法

数据用SPSS 18.0 软件进行统计分析。用Haploview 软件对研究对象进行SNP Hardy-Weinberg 平衡检验，以此来确认研究对象选取的随机性。正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本均数的比较用t 检验。等位基因频率及基因型频率比较以及不同基因型间主要结石成分比较用χ2检验。用比值比（OR）和95%的可信区间（95%CI）来评估肾结石与基因型的关联强度。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡检测

对实验样本进行基因型Hardy-Weinberg 平衡检测，结果显示SLC2A9 基因rs938552 位点的基因型期望值与观察值吻合（P＞0.05），说明所选标本可代表随机婚配群体。见表1。

2.2 SLC2A9 基因rs938552 位点基因分型结果

SLC2A9 基因rs938552 位点有野生型（CC）、杂合型（CT）、突变型（TT）三种基因型。两组SLC2A9 基因rs938552 位点CC、CT 和TT 基因型频率比较差异有统计学意义（P＜0.001），两组等位基因C、T 频率差异也有统计学意义（P＜0.001）。见表2。携带SLC2A9 基因rs938552 位点杂合型及突变型（CT+TT）的人群其结石发病风险高于携带野生型（CC）的人群，前者发生结石的风险是后者的2.933 倍（OR=2.933，95%CI：1.632～5.264，P＜0.001）。

2.3 SLC2A9 基因rs938552 位点基因型与血、尿生化指标的关系

病例组携带SLC2A9 基因rs938552 位点CC型与携带CT+TT 型者相比，前者血液尿酸和尿液尿酸、尿钙低于后者（P 均＜0.05），而尿液pH值高于后者（P＜0.05），其余指标差异无统计学意义（P 均＞0.05）。见表3。

表1 SLC2A9 基因rs938552 位点基因型分布Hardy-Weinberg 平衡检验［例（%）］

表2 病例组及对照组SLC2A9 基因rs938552 位点基因型和等位基因频率比较［例（%）］

2.4 病例组SLC2A9 基因rs938552 基因型与结石主要成分的关系

结石的化学成分有单纯性与混合性。单纯性结石以草酸钙为主，混合性结石以草酸钙/尿酸铵、草酸钙/尿酸、磷酸钙/磷酸镁铵多见。结石的主要成分包括草酸钙、尿酸、尿酸铵、磷酸钙和磷酸镁铵。携带SLC2A9 基因rs938552 位点CC 型与CT+TT 型者比较，后者草酸钙和尿酸的比例高于前者（P 均＜0.05）。见表4。

3 讨论

在泌尿系结石的成因分析中，遗传因素越来越受到人们的关注[8]。SLC2A9 是调控尿酸重吸收的重要因子，主要参与糖类代谢。SLC2A9 基因表达差异与尿酸转运之间存在很强的相关性[9]，是血尿酸代谢最重要的调节因子[10]。Polasek 等[5]研究发现，欧洲人群存在SLC2A9 基因SNP 位点多态性。国内也有SLC2A9 基因多态性的相关报道，尹逸丛[11]、张翻弟[12]等研究发现SLC2A9基因在我国西北人群中存在SNP 位点多态性，rs7442295 位点的多态性与低尿酸血症相关；而rs2241480 位点的多态性与高尿酸血症具有相关性。

尿酸又称为2，6，8-三氧嘌呤，呈弱酸性，是人体内嘌呤氧化分解代谢的终末产物，经肾脏代谢途径排出体外，包括肾小球滤过、肾小管重吸收、肾小管再分泌及分泌后再次重吸收。在调节血尿酸水平中，肾小管对尿酸的重吸收和分泌起着非常重要的作用。何群等[13]对191 例有完整血生化及24 h 尿分析结果的结石病患者进行了系统统计，高尿酸尿症患者54 例，占28.3%，与国外的研究结果[14-15]一致。

本文对华东地区汉族人群300 例肾结石患者及300 例健康对照者进行了检测，发现SLC2A9基因rs938552 存在多态性，携带有CT 和TT 的人群患肾结石的风险是携带CC 人群的2.933倍，杂合型和突变型患者血清和尿液中的尿酸均高于野生型，表明SLC2A9 基因rs938552 的变异与高尿酸血症密切相关。研究还发现，杂合型和突变型患者与野生型比较，血钙差异无统计学意义，但尿钙却高于后者。携带有CT 和TT 人群的结石主要成分中，草酸钙和尿酸的比例高于CC基因型。高尿酸血症患者的尿液中尿酸量剧增，可形成尿酸结石并诱发含钙结石[16-17]。因此，推测SLC2A9 基因rs938552 位点的多态性可导致肾小球和肾小管对尿酸、钙的滤过和重吸收出现异常，形成高尿酸血症、高钙尿症，进而导致肾结石的发生。对SLC2A9 基因的深入研究也许可以找到与肾结石相关的分子机制，为筛选今后作为治疗的靶点基因提供依据。

表3 病例组SLC2A9 基因rs938552 位点基因型与血、尿生化指标的关系（±s）

表3 病例组SLC2A9 基因rs938552 位点基因型与血、尿生化指标的关系（±s）

生化指标 CC（n=239） CT+TT（n=61） t 值 P 值血生化指标尿酸/（mm ol·L-1） 326.8±15.34 363.74±18.18 -16.143 0.006肌酐/（μmol·L-1） 86.29±12.77 82.58±11.14 2.076 0.096钙/（mmol·L-1） 2.24±0.48 2.08±0.43 2.373 0.125磷/（mmol·L-1） 1.13±0.31 1.15±0.27 -0.461 0.339钾/（mmol·L-1） 4.08±0.61 3.74±0.69 3.781 0.419钠/（mmol·L-1） 141.43±3.81 142.56±4.07 -2.039 0.354镁/（mmol·L-1） 0.98±0.09 0.95±0.11 2.216 0.261 24 h 尿生化指标pH 值 6.85±0.79 5.69±0.61 10.679 0.013尿酸/mmol 3.61±0.49 4.17±0.53 -19.149 0.032草酸/mg 68.27±11.31 75.23±13.46 -4.121 0.087枸橼酸/mg 349.26±43.14 313.25±37.18 6.433 0.341钙/mg 6.42±0.75 7.35±0.85 -8.47 0.025磷/mmol 38.28±6.17 41.28±5.94 -3.415 0.163钾/mmol 31.15±6.36 33.63±7.17 -2.647 0.573钠/mmol 154.66±19.17 163.28±21.52 -3.056 0.821镁/mmol 79.58±7.61 82.15±6.57 -2.417 0.078

表4 病例组SLC2A9 基因rs938552 位点基因型与结石主要成分的关系［例（%）］