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表没食子儿茶素没食子酸酯对2型糖尿病大鼠认知功能的影响及其机制研究

2021-03-05刘行海徐策买文丽郑倩刘华刘红

川北医学院学报 2021年1期
关键词:认知障碍海马试剂盒

刘行海,徐策,买文丽,郑倩,刘华,刘红

(川北医学院生理学教研室,四川 南充 637000)

认知障碍是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的重要慢性并发症,病情加重会进展为痴呆,从而降低患者生活质量,增加患者病死率,然而其发病机制目前尚未完全明了[1]。近年来,研究[2]发现炎症反应参与了T2DM认知障碍的发生发展。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)作为绿茶主要生物活性成分之一,具有抗氧化、抗凋亡、降血脂及神经保护等作用[3-4]。本研究以海马组织炎症为切入点,观察EGCG对T2DM认知障碍的改善作用是否与抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及核因子-κB p65(NF-κB p65)的表达有关,以期为EGCG临床用于T2DM认知障碍防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

30只清洁级雄性Wistar大鼠,体重为(195±16)g,由川北医学院动物中心提供。链脲佐菌素(美国Sigma公司);血清胰岛素检测试剂盒(北京北方生物技术研究所);血糖仪(长沙三诺科技公司);EGCG(上海源叶生物科技有限公司);TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(美国R&D公司);BCA蛋白检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);NF-κB p65抗体、β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司);水迷宫计算机图像实时分析系统(成都泰盟科技有限公司);电泳仪(北京六一仪器厂);酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 T2DM动物模型建立、分组及干预 从30只大鼠中随机分出8只作为对照组,另22只参照文献[5]方法建模。以空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)>7.8 mmol /L,同时伴有胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)降低,作为复制T2DM模型成功的判断标准[6]。实验中实际建模成功17只大鼠,将其随机分成EGCG组(n=8)和模型组(n=9)。EGCG组灌胃给EGCG,剂量为40 mg /kg,1次/d,对照组和模型组每次灌胃等体积生理盐水,连续4周。期间各组大鼠常规饲料饲养,自由饮水。

1.2.2 Morris水迷宫法测试认知功能 大鼠干预4周后进行水迷宫实验[7]:(1)定向航行实验,历时5 d,记录逃避潜伏期,即2 min内寻找平台所需时间;(2)空间探索实验,记录大鼠在2 min内跨越原平台所在位置的次数。

1.2.3 标本采集与指标测定 水迷宫测试实验完成后,空腹12 h,经心脏穿刺采血制备血清标本,保存于-80 ℃待测。快速断头取脑,冰上分离海马组织,保存于-80 ℃待测。血糖仪测定FBG;按试剂盒说明书检测FINS水平及海马组织TNF-α和IL-6含量。

1.2.4 Western blotting检测海马组织NF-κB p65蛋白表达 称取海马组织,提取总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,蛋白通过10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后,采用半干式转膜法转至PVDF膜,封闭,加入NF-κB p65一抗(1∶300)及β-actin一抗(1∶1 000),4 ℃孵育过夜,用TBST洗涤膜3次,每次10 min,加入二抗(1∶3 000),室温孵育1 h,用TBST洗涤膜3次,每次10 min。采用化学发光法显色,以β-actin为内参,image J软件图像分析系统对条带进行灰度分析。NF-κB p65蛋白的相对表达水平用NF-κB p65蛋白与内参β-actin灰度值的比值表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况比较

与对照组比较,模型组大鼠具有饮水量增加,食量增加,尿量增加,但是活动却明显减少,反应较迟钝,毛发显晦暗等糖尿病典型症状。在实验进程中,模型组大鼠体重有减少趋势,但上述其它症状和体征更加明显。EGCG组大鼠上述情况均有改善。

2.2 认知功能实验结果比较

与对照组比较,模型组大鼠的逃避潜伏期增加,跨越原平台位置的次数减少(P<0.05);与模型组比较,EGCG组大鼠的逃避潜伏期减少,跨越原平台位置的次数增加(P<0.05)。见表1。

表1 认知功能实验结果比较

2.3 FBG、FINS和ISI比较

与对照组比较,模型组大鼠的FBG和FINS升高,ISI降低(P<0.05);与模型组比较,EGCG组大鼠的FBG和FINS降低,ISI升高(P<0.05)。见表2。

表2 FBG、FINS和ISI比较

2.4 海马组织TNF-α和IL-6含量比较

与对照组比较,模型组大鼠海马TNF-α和IL-6含量升高(P<0.05);与模型组比较,EGCG组大鼠海马TNF-α和IL-6含量降低(P<0.05)。见表3。

表3 海马TNF-α和IL-6含量比较

2.5 海马组织NF-κB p65蛋白表达比较

与对照组比较,模型组大鼠海马NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,EGCG组大鼠海马NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图1。

3 讨论

本课题组既往研究发现,采用高脂饮食联合链脲佐菌素,能复制出临床症状和学习记忆相近的T2DM大鼠模型,而给予EGCG 10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃治疗后,尤其以40 mg/kg剂量效果最好。本实验中,模型组大鼠出现了明显的空间学习记忆减退,即逃避潜伏期明显延长,跨越原平台位置次数减少;经EGCG 40 mg/kg治疗后的大鼠逃避潜伏期明显缩短,跨越原平台位置次数增多,提示EGCG可以改善T2DM大鼠空间学习记忆的减退。

脑内炎症反应是T2DM认知障碍重要发病机制之一。NF-κB是炎症起始的核心调控因子[8]。有研究[9]表明,激活的NF-κB转位到细胞核,可诱导多种细胞因子如TNF-α、IL-6、细胞粘附分子、C反应蛋白和趋化因子等的基因表达。国内外研究[10-11]结果表明,通过抑制NF-κB通路活化可达到抗炎效果。TNF-α和IL-6是体内重要的促炎细胞因子。学习记忆是认知功能的主要方面,而脑海马组织是学习记忆的重要整合中枢。有研究[12]报道,海马区中小胶质细胞活化后将产生大量IL-6、IL-1β等炎症因子,导致脑内免疫反应加重及大量细胞死亡,从而进一步损害学习记忆能力。还有研究[13-15]证实,TNF-α和IL-6在学习记忆能力减退的大鼠海马组织中的表达明显升高,通过减少炎症因子TNF-α和IL-6的表达可有效改善糖尿病大鼠认知功能。本实验发现,与对照组比较,模型组海马组织活化的NF-κB增加即NF-κB p65亚基蛋白表达增多,炎症因子TNF-α和IL-6含量升高,也进一步证实T2DM大鼠的海马组织存在明显的炎症。给予EGCG治疗后,大鼠海马组织NF-κB p65蛋白表达、炎症因子TNF-α和IL-6含量均显著低于模型组,提示EGCG通过降低海马组织中NF-κB的活化,减少炎症因子TNF-α、IL-6的产生,减轻海马组织炎症反应,进而改善T2DM大鼠空间学习记忆能力。

综上所述,EGCG能明显抑制T2DM大鼠海马炎症因子TNF-α,IL-6的产生以及NF-κB p65蛋白表达,并显著改善T2DM大鼠空间学习记忆能力,其可能的机制是通过减轻海马炎症反应,从而起到神经保护作用。但EGCG对T2DM大鼠认知功能的改善可能存在多部位、多途径的作用机制,其具体机制仍有待深入研究。

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