生防芽孢杆菌与杀菌剂的筛选复配及对栾树枝枯病防控效果

曾艳玲，刘 韩，黎肇家，李姝江*

（1.长江上游森林资源保育与生态安全国家林业和草原局重点实验室/四川农业大学林学院，成都 611130；2.四川省甘孜州林业科学研究所，四川康定 626001）

栾树枝枯病由小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum）引起的枝干病害[1]。枝枯病可致栾树枝条无法正常生长，病害严重会导致整个枝条干枯死亡，药用价值、观赏价值、园林绿化价值、经济价值降低，造成严重的经济损失。中国北部及中部大部分省区均有栾树枝枯病的发生。小新壳梭孢是一种木本植物病害常见病原菌。小新壳梭孢可以导致多种木本植物发生多种病害，可以侵染桉树，导致桉树枝干枯萎[2-3]；能使麻风树发生芽枯病[4]；能使柑橘果实腐烂[5]；蓝莓、核桃枝干枯死等[6-7]。目前对小新壳梭孢引起的病害防治主要是依靠苯醚甲环唑、多菌灵和甲基硫菌灵等化学药剂防治为主[2，8]。然而，化学药剂长期使用破坏生态环境，并且长期使用高浓化学药剂对人体健康存在潜在的威胁[9-10]，病原菌容易产生抗药性[11-12]。生物防治具有低毒、绿色环保的优点，但易受环境、气候、定殖能力等的影响，存在大田防效差、显效慢等特点。目前已有多种菌药联用增效组合的报道，将生物防治与化学防治相结合，不但能控制病害，而且降低化学药剂使用浓度。该策略在植物保护研究领域被广泛研究，且取得了良好效果[13]。W.Saksirirat等[14]认为代森锰锌与木霉结合使用能有效地控制马铃薯茎腐病。枯草芽孢杆菌与氟环唑联用对禾谷镰孢霉的增效作用，结果表明：菌药联用对禾谷镰孢霉的最高抑菌活性可达74.44%，表现增效和持效作用[15]。牛赡光等[16]的研究表明，多菌灵对荧光假单胞杆菌P32的存活和定殖有一定的促进作用，并提高了P32防治棉花黄萎病的效果。但是利用生防芽孢杆菌和化学药剂协同防治小新壳梭孢引起的植物病害鲜有报道。为减少化学农药的使用量，延缓抗药性，实现化学农药的减量增效，本研究将筛选具有对小新壳梭孢抑制作用的化学药剂与解淀粉芽孢杆菌进行复配，以期为防治病害提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料

枯草芽孢杆菌菌株 BS（Bacillus subtilis）、贝莱斯芽孢杆菌BV（Bacillus velezensis）、解淀粉芽孢杆菌 BA（Bacillus amyloliquefaciens）、甲基营养型芽孢杆菌BM（Bacillus methylotrophicus）、小新壳梭孢NP（Neofusicoccum parvum）均由四川农业大学林木病理实验室提供，分离自四川广安前锋区栾树苗圃的两年生健康栾树。发病栾树采自于四川广安前锋区栾树苗圃两年生苗木；盆栽栾树采购自成都市众鑫丹桂苗木专业合作社一年生苗木。基质为市销营养土和自然土按1∶2混匀。50%多菌灵（四川国光农化股份有限公司），50%咪鲜胺（江苏辉丰生物农业股份公司），30%甲霜-噁霉灵（河南省开封市浪潮化工有限公司），40%菌核净（浙江斯佩斯植保有限公司），80%代森锰锌（郑州宏顺化工产品有限公司），80%福·福锌（山东东合生物科技有限公司），78%波尔多-锰锌（美国仙农有限公司），农泰乐70%丙森锌可湿性粉剂（江苏利民化工股份有限公司），66.5%霜霉威盐酸盐（河北中保绿农作物科技有限公司），47%春雷王铜（陕西麦可罗生物科技有限公司）。

1.2 培养基及发酵液制备

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL）；LB 培养基（酵母浸粉5 g、氯化钠10 g、胰蛋白酶10 g）。使用100 mL LB培养液培养芽孢杆菌菌株24 h得到发酵液。

1.3 4种芽孢杆菌对病原菌的室内抑菌筛选

1.3.1 芽孢杆菌菌悬浮液抑菌效果

取芽孢杆菌发酵液，离心去掉上清液，菌体重新用无菌水悬浮使菌体浓度达到1×107cfu/mL。选用对峙平板法[17]测定芽孢杆菌对病原菌的抑菌效果，根据菌体悬浮液抑菌效果筛选出抑菌率具有显著高的芽孢杆菌。抑菌率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌块直径）×100%。

1.3.2 芽孢杆菌发酵液无菌上清液抑菌效果

挑取芽孢杆菌发酵液，离心，将上清液移到新的无菌离心管，去掉菌体，上清液反复经过0.22 μm滤膜过滤除去残余菌体，制成无菌上清液。采用琼脂扩散法[18]测定抑菌效果。抑菌率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌块直径）×100%。

1.3.3 芽孢杆菌粗提取物的抑菌效果

向无菌上清液加入硫酸铵盐析[19]（饱和度30%、40%、50%、60%、70%），搅拌均匀，4℃放置 48 h，双层滤纸过滤后，用去离子水溶解沉淀，再反复经过0.22 μm微孔滤膜过滤灭菌，滤液用于检测抗菌活性。收集所有经过微孔滤膜过滤的溶液，将收集好的溶解加入甲醇旋涡搅拌混匀，在4℃，6 000 r/min下离心10 min，去掉硫酸铵盐分沉淀，即得粗提取物。粗提取物采用紫外吸收法（OD280）测定浓度[20]。粗提取物经过0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用于抗菌活性检测，测定抑菌率。

1.4 化学杀菌剂对小新壳梭孢的室内毒力筛选[21]

采用生长速率法[22]测定杀菌剂对小新壳梭孢菌丝生长的抑制率。将供试药剂分别稀释：5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L 用于试验浓度梯度，多菌灵试验浓度设计为 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg/L。采用十字交叉法[23]测定各处理的菌落直径，并通过抑菌率计算EC50值[24]、P值。比较毒力大小及抑菌效果，筛选最佳抑菌效果的药剂作为后续利用。

1.5 化学杀菌剂与芽孢杆菌混合搭配对病原菌的室内筛选

1.5.1 化学杀菌剂对芽孢杆菌菌株生长的影响

以化学杀菌剂50 mg/L浓度为母液，将母液药剂配制成含药 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg/L 的 LB液体培养基200 mL。根据1.3筛选结果，将目标芽孢杆菌悬液50 μL接入含化学药剂LB液体培养基中，25℃，150 rpm/min培养24 h。经过含药培养基培养之后，芽孢杆菌悬浮液OD600值[25]。

1.5.2 联合毒力测定

以测定杀菌剂和粗提物有效中量EC50值为基础，配制50倍母液Wadley法确定复配比例混合单剂成为复合剂[26]，设计杀菌剂与粗提物（V杀菌剂∶V粗提物）复配比例为2∶0、1∶1、1∶2、1∶4、2∶1、4∶1、5∶1、7∶1、0∶2。制成含复合剂的PDA培养基，使培PDA养基中复合剂体积浓度为2.00%。同时分别设计以杀菌剂和粗提物EC50值为基础的单剂抑菌率试验，单剂试验按在复合配比中所占有的比例进行试验，用十字交叉法测定各处理的菌落直径，并计算实际抑菌率，采用Horsfall方法[27]评价复配联合毒力作用。

1.6 栾树枝枯病盆栽防治试验

采用伤口接种法[28]检测栾树枝枯病防治效果。在栾树苗木枝干需要划伤处作标记，用无菌水洗净并用酒精棉消毒后，灭菌刀片在标记处横纵交叉划伤造成轻微伤口；将生长3 d的菌饼接种到伤口处，保鲜膜包裹纱布保湿，每隔2 d揭开纱布不揭开保鲜膜观察是否需要更换菌饼，常规管理。苗木发病后，依次用筛选出来的化学杀菌剂（4 mg/L）、芽孢杆菌发酵液（OD600为1.522）、芽孢杆菌粗提取物（OD600为 0.079）、复合剂（100%）、蒸馏水（CK）涂布处理发病部位，30 d后记录发病情况、计算病情指数和防治效果（表1）。

表1 枝干病害分级标准Table 1 Classification criteria of branch diseases

病情指数=［∑（病级株数×代表数值）］/（株数总和×发病最重等级的代表数值）

防治效果=[对照病情指数-处理病情指数]/对照病情指数×100%

1.7 数据分析

试验数据采用origin2018和SPSS 22.0软件分析处理，LSD 法做多重比较分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 4种芽孢杆菌对病原菌抗菌效果的室内筛选

2.1.1 芽孢杆菌菌悬液的室内抑菌筛选

初步筛选结果如表2所示，枯草芽孢杆菌的抑菌率为41.65%，显著低于其他菌株。因此通过菌体对小新壳梭孢的抑菌率筛选贝莱斯芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌进入下阶段筛选。

表2 4种芽孢杆菌悬浮液对病原菌抑菌率Table 2 The antifungal rate of four Bacillus suspensions to pathogen（5 days）

2.1.2 无菌上清液对枝枯病菌的抑菌效果

如图1显示3种菌的抑菌率随着培养时间的推移，抑菌率先上升再下降。贝莱斯芽孢杆菌培养液的抑制率总是小于甲基营养型芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，甲基营养型芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的培养液对小新壳梭孢的抑制作用明显，筛选出甲基营养型芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌进入下一个阶段。

图1 无菌上清液对病原菌的抑菌率随时间变化趋势图Figure 1 Trend chart of antibacterial rate of sterile supernatant with time

2.1.3 粗提取物筛选

试验发现甲基营养型芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌经过硫酸铵沉淀之后的培养液所含的非蛋白类对小新壳梭孢无抗菌活性（抑菌率为0），而蛋白类提取物质对小新壳梭孢具有抑制效果（表3），且解淀粉芽孢杆菌粗提取物抑菌率显著高于甲基营养型芽孢杆菌粗提取物（Sig＜0.05），说明解淀粉芽孢杆菌的蛋白类代谢物对小新壳梭孢的抑菌能力强于甲基营养型芽孢杆菌。因此，选择解淀粉芽孢杆菌作为筛选之后的拮抗菌菌株。

表3 芽孢杆菌蛋白类代谢物在不同硫酸铵浓度沉淀下对病原菌的独立性检验Table 3 Independence test of two bacillus protein metabolites under different ammonium sulfate concentrations for pathogens

2.2 化学杀菌剂对小新壳梭孢的室内毒力筛选

在10种化学药剂对小新壳梭孢毒力试验中（表4），50%多菌灵可湿性粉剂EC50值最小，抑菌效果最佳，其次是50%咪鲜胺-锰锌可湿性粉剂，且EC50值相差较小。毒力效果较差的是40%菌核净可湿性粉剂和80%代森锰锌可湿性粉剂；80%福-福锌可湿性粉剂、78%波尔多-锰锌可湿性粉剂和70%丙森锌可湿性粉剂对病原菌基本没有毒力作用，EC50值超过100 mg/L。毒力回归方程斜率B值与病原菌对药剂的敏感性成正相关关系，47%春雷王铜可湿性粉剂和66.5%霜霉威盐酸盐水剂毒力试验B为负值，在毒理学上不成立，对小新壳梭孢毒力试验所测得的EC50值也不成立，对小新壳梭孢没有抑菌效果。B值最大为40%菌核净可湿性粉剂约2.185，但40%菌核净可湿性粉剂EC50较大不适合作为小新壳梭孢的防治药物。50%多菌灵可湿性粉剂EC50小于50%咪鲜胺-锰锌 EC50，B值高于50%咪鲜胺-锰锌，说明小新壳梭孢对50%多菌灵可湿性粉剂的敏感度增强幅度强于50%咪鲜胺-锰锌。因此根据化学药剂毒力测试筛选结果，50%多菌灵可湿性粉剂适合作为小新壳梭孢化学防治药剂选择。

表4 10种化学药剂对小新壳梭孢的毒力效果Table 4 Toxicity of 10 fungicides to Neofusicoccum parvum

2.3 化学杀菌剂与芽孢杆菌混合搭配对病原菌的室内筛选

2.3.1 多菌灵对解淀粉芽孢杆菌生物相容性

经过含药LB培养基培养24 h之后，含药培养基浑浊，对照组澄清，即解淀粉芽孢杆菌与多菌灵有良好的生物相容性，经过分光光度计测定每个含药培养基OD600值，各个培养基菌液OD600均在1.027～1.037之间（表5），各个多菌灵药剂浓度对解淀粉芽孢杆菌生长速度没有影响。多菌灵和解淀粉芽孢杆菌可以共存并没有出现抑制生长速度的情况，所以多菌灵和解淀粉芽孢杆菌可以相互混合搭配。

表5 解淀粉芽孢杆菌在含药LB培养基培养24 h OD600值Table 5 OD600values of Bacillus amyloliquefaciens cultured in drug-containing LB medium for 24 h

2.3.2 粗提物抗菌效果

解淀粉芽孢杆菌粗提物抑菌试验结果显示，当粗提物浓度达到70 ml/L时，抑菌率达到50%以上，EC50值为68.0070mg/L。毒力回归方程斜率为4.1034，该斜率大于多菌灵毒力回归方程斜率值（1.205 7），则说明小新壳梭孢对粗提物敏感度高于对多菌灵的敏感度。

2.3.3 复配剂对病原菌的毒力测定

对于小新壳梭孢而言，复合剂实际抑菌率随着配比比例的变化而变化，变化趋势随着多菌灵比例的提高而提高。当V（多菌灵）∶V（粗提物）比例为1∶4和 1∶2时，IR＜1，属于拮抗作用；比例为 1∶1到 7∶1时，IR＞1，则为加和作用，其中 5∶1是增效作用IR最大为1.222。

V（多菌灵）∶V（粗提物）为 5∶1 为优选复配比例。

2.4 栾树枝枯病的盆栽防治效果

栾树枝枯病防治效果如表8所示，所选的药剂对栾树枝枯病防治表现出良好的防治效果，施加药剂处理组无叶片枯萎现象，而对照组栾树出现叶片缺水枯萎现象（图2）。防治效果最佳为复合剂，复合剂处理组发病率为27.80%，病情指数均为15.62%，防治效果为81.99%，防治效果显著高于其他防治试剂。接种防治试剂后栾树发病明显缓慢，对照组发病率高达为90.42%，病情指数71.43%显著高于试验组。粗提物防治效果低于多菌灵，而复合剂防治效果增强，多菌灵成分对防治效果起主导作用，解淀粉芽孢杆菌代谢产物在防治起辅助作用。多菌灵在芽孢杆菌代谢产物的辅助下，防治效果增强，防治效果所反映的效应与室内毒力试验基本一致。

图2 药剂对栾树枝枯病盆栽防治效果Figure 2 Prevention effect of fungicides on potting of Koelreuteria bipinnata branch withered disease

表6 解淀粉芽孢杆菌粗提物对病原菌的毒力测定Table 6 Toxicity of crude extract of Bacillus amyloliquefaciens to Neofusicoccum parvum

表7 复配剂对病原菌的毒力试验Table 7 Toxicity test of compounding agents to pathogenic bacteria

表8 药剂对栾树枝枯病盆栽防治效果Table 8 Prevention effect of fungicides on potting of Koelreuteria bipinnata branch withered disease

3 讨论

枝枯病是危害比较严重的一种枝干病害，能够危害林木的主干、大枝和小的枝条，林木被枝枯病病原菌侵染以后，轻则树皮腐烂，影响养分传输，重则整个枝条或者整棵树死亡。枝枯病的防治方法包括增强树势或在秋天落叶后和春天萌芽前在枝干喷施药剂预防；发病初期及时刮除病斑，并涂药剂防护。当前防治枝枯病的主要药剂是化学杀菌剂，但是长期大量使用化学药剂破坏生态的弊端不容忽视。本研究所筛选的解淀粉芽孢杆菌在其生长过程中能够产生多种抑菌物质，具有广泛抑制真菌与细菌的功能，近年来解淀粉芽孢杆菌作为益生菌的应用方面的研究与探索越来越多[29]，和其他生防菌一样存在诸如防效不稳定和商业化困难等问题。已有研究表明：化学药剂有助于生防微生物克服包括病原菌在内的自然环境中习居微生物的排斥作用，使其能够顺利地在各种土壤生态环境中定殖、繁殖，并形成优势种群，从而更好地发挥生物防治作用。两种植物病害防治方式相协同可以相互补充各自的短处发挥各自的优势，增强防治效果[30]。

生防微生物与化学药剂协同防治植物病害既能达到预期防治效果又能减少化学药剂的使用，本试验结果也证实了这种情况：利用50%多菌灵可湿性粉剂与解淀粉芽孢杆菌粗提物复配成新的复合剂，其中50%多菌灵可湿性粉剂与解淀粉芽孢杆菌粗提物复配比例为5∶1增效作用最强。盆栽试验防治效果以复合剂最佳，复合剂防治效果为83.83%，显著优于单剂防治效果（粗提物防治效果66.14%；多菌灵防治效果74.98%）。单剂试验中多菌灵单剂防治效果优于芽孢杆菌代谢产物单剂，而复合剂因有芽孢杆菌代谢产物的参与，不仅可以减少多菌灵药剂的使用，还可以增强多菌灵杀菌效果，提高防治效果，即高效又降低环境污染。

盆栽试验结果与室内毒力试验结果基本一致，但是这只是在室内和盆栽进行的试验，大部分环境条件均可以通过人为控制，而自然条件是复杂多样的、是不可控制的，因而在自然条件下，复合剂和药剂单剂对栾树枝枯病的防治效果要取得良好的效果还需要进一步等待研究。本研究只针对栾树枝枯病病原菌进行了筛选复配对应的药剂，因此本试验涉及的其他芽孢杆菌如甲基营养型芽孢杆菌是否也能与多菌灵或其他杀菌剂进行复配，复配后是否也能提高防治效果；多种芽孢杆菌是否能与杀菌剂复配等问题，以及关于如何增强菌药联用后芽孢杆菌拮抗代谢物质对靶标病原菌的抑菌活性，也将成为下一步研究的关键。通过研究其菌药联合增效机制，可以更清楚地了解如何使二者达到优势互补，发挥多位点、多途径的特点，从而达到减少化学药剂用药量、增强防效的目的。