土壤微塑料残留对大豆幼苗生长及生理生化特征的影响

安 菁，刘欢语，郑 艳，程 俊，宋 春*

（1.四川农业大学环境学院生态环境研究所，成都 611130；2.四川农业大学农学院，成都 611130）

我国是农业大国，累积农膜使用量已超过250万t[1]。大块的农膜经破碎、风化等一系列作用逐渐变为粒径较小的塑料碎片，最终以微塑料的形式滞留在土壤中[2]。由于含微塑料有机废物的循环利用以及塑料地膜的大量使用，农业土壤中积累的微塑料积累量实际上比水域生态系统更多[3-4]。Zhang G.S.等[5]于2016年调查发现我国西南地区土壤团聚体中微塑料的平均丰度为18 760个/kg土壤，其中粒径＜1 mm的微塑料丰度最高，且塑料颗粒在耕地土壤中的积累日益增长。

研究表明，微塑料具有高疏水性和较大的比表面积，其在环境中通常难以降解，对环境的危害主要表现为以下两方面：一是通过生态循环进入生物体引起细胞毒性、遗传毒性、神经毒性、生殖毒性、氧化应激及损伤和行为异常等生态毒理学效应，严重时甚至会导致生物死亡；二是吸附周围环境污染物和病原体，通过食物链传递、富集，对生态系统构成威胁[6]。土壤环境中微塑料的残留会通过一系列物理和化学作用抑制土壤微生物的活性，进而对植物生长发育造成一定影响[7-8]。目前国内外对微塑料生理毒性的研究多集中于水体动物，对陆地植物的影响研究刚刚起步[9]，关于土壤微塑料残留对高等植物生长胁迫及植物对此作出的抗性反应鲜见报道。本研究通过向土壤中添加聚氯乙烯微塑料颗粒，分析土壤微塑料不同残留量下大豆苗期生长发育及生理生化特征，旨在探讨农田土壤微塑料残留对农作物的生态毒理效应。

1 材料和方法

1.1 供试材料

试验于2019年5月—6月在日光型人工气候室（白天温度25℃，夜晚温度20℃，相对湿度60%）内进行。供试土壤采自四川农业大学现代农业研发基地，土壤基本理化性状如表1所示。供试大豆品种为当地主栽品种南豆12，由四川省南充市农科院提供。微塑料材质为粒径＜15 μm的PVC颗粒，以下简称mPVC，购自东莞市静天塑料原料有限公司。盆栽试验栽培盆子尺寸为40 cm×22 cm×11 cm，每盆装风干土10 kg。

表1 供试土壤的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of soil tested

1.2 试验设计

试验共设置4个处理，即对照（CK），以田间农膜残留量151 kg/hm2[5]为依据，换算为盆栽微塑料添加量为 0.054 g/kg，CK 的 10倍（T1）、30倍（T2）和 50 倍（T3），微塑料添加量分别为 0.54、1.62和2.70 g/kg土壤。每个处理重复3次。每盆播种大豆12粒（定植9株），出苗后每日观察苗情长势及土壤水分，用喷壶灌溉补充水分，保证土壤水分充足。

1.3 样品采集与测定

1.3.1 株高、叶面积、根鲜重的测定

分别于大豆出苗后第7、14和21天测定株高，并进行破坏性取样，每次每盆取3株植物样。将大豆植株分为地上部和地下部。采取主茎或主枝顶部新长成的健壮叶或功能叶采用数格子法[10]测定叶面积。将根系用自来水清洗干净，用吸水纸吸出多余水分，测定根鲜重。

1.3.2 根系活力的测定

采用-萘胺法[11]测定植物根系活力。

1.3.3 叶绿素含量

采用分光光度法[12]，用乙醇提取植物叶片中的叶绿素，根据Lambert-Beer定律在645、663 nm波长下测得植物叶片叶绿素a、叶绿素b含量。

1.3.4 叶片SOD、POD和CAT活性、MDA和可溶性蛋白含量的测定

采用四氮唑蓝（NBT）法[13]测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈创木酚显色法[13]测定过氧化物酶（POD）活性，紫外分光光度法[13]测定过氧化氢酶（CAT）活性；在酸性高温条件下采用硫代巴比妥酸（TBA）法[14]测定中丙二醛（MDA）含量；用常规的考马斯亮蓝（G-250）法[15]测定可溶性蛋白质含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，用单因素方差分析法（ANOVA）进行差异显著性分析。采用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 微塑料对大豆植株形态的影响

不同微塑料残留量土壤中大豆的叶面积、株高和根鲜重如图1所示。大豆出苗后第7天，与CK相比，处理 T1、T2和 T3的叶面积均显著降低（P＜0.05），分别降低了6.2%、12.7%和9.9%；处理T2和T3的株高分别降低了6.4%和16.5%（P＜0.05）；处理T3的根鲜重降低了21.5%（P＜0.05）。大豆出苗后第14天，与CK相比，处理T2和T3的叶面积分别降低了17.6%和 25.4%（P＜0.05）；处理 T1、T2和 T3的株高分别降低了 17.1%、14.3% 和 21.8%（P＜0.05）；处理 T2和 T3的根鲜重分别降低了18.3%和25.4%（P＜0.05）。出苗后第21天，处理T1、T2和T3的大豆叶面积、株高和根鲜重与CK相比，均无显著差异。

图1 微塑料对大豆幼苗生长发育的影响Figure 1 Effects of microplastics on growth and development of soybean seedlings

2.2 微塑料对大豆苗期根系活力的影响

根系是植物活跃的吸收器官和合成器官。根的生长情况和代谢水平即根系活力直接影响大豆地上部分的生长、营养状况，是植物生长的重要生理指标之一。微塑料添加量的增加对大豆根系活力均表现出一定的抑制作用（图2），其中，在大豆出苗后第7天和第21天，T3处理根系活力显著低于CK，分别降低了2.7%、2.2%；大豆出苗后第14天，与CK相比，处理T1、T2和T3的根系活力分别降低了1.8%、1.7%和 1.3%（P＜0.05）。

图2 微塑料对大豆幼苗根系活力的影响Figure 2 Effect of microplastics on root vitality of soybean seedlings

2.3 微塑料对大豆叶绿素的影响

由图3可以看出，大豆出苗后第7天，处理T1、T2和T3的叶绿素a/b值与CK相比，均无显著差异（图3A）；处理T1、T2和T3的叶绿素含量（叶绿素a与叶绿素b之和）显著高于CK（P＜0.05），分别增加了5.2%、4.6%和5.6%（图3B）。出苗后第14天，处理 T1、T2和 T3的叶绿素含量显著低于 CK（P＜0.05），分别降低了3.2%、8.5%和2.5%（图3B）。出苗后第21天，处理T1和T3的叶绿素a/b值显著低于CK（P＜0.05），分别降低了 13.3%和 12.7%（图 3A）；处理T1的叶绿素含量与CK相比，降低了13.5%（P＜0.05）（图 3B）。

图3 微塑料对大豆幼苗叶绿素a/b（A）和叶绿素含量（B）的影响Figure 3 Effect of microplastics on chlorophyll a/b(A)and chlorophyll content(B)in soybean seedlings

2.4 微塑料对大豆抗氧化能力的影响

植物抗氧化能力的强弱体现了其受外界逆境影响的程度。不同mPVC含量对大豆叶片抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性以及膜质过氧化物丙二醛（MDA）和细胞渗透调节物质（可溶性蛋白）含量均造成了一定程度的影响（图4、图5）。大豆出苗后第7天，处理T1、T2和T3的大豆叶片SOD活性显著提升（图4A），较CK分别升高了52.4%、67.0%和91.1%（P＜0.05）。大豆出苗后第 14天，处理 T2和T3的SOD活性较第7天降低了近1/2，但仍显著高于CK（P＜0.05）。大豆出苗后第21天，所有处理大豆SOD活性进一步降低，但处理T1、T2和T3的SOD活性仍然显著高于CK，较CK分别升高了14.8%、18.6%和24.6%（P＜0.05）。POD活性随着生育时期的延长呈逐渐升高趋势（图4B）。出苗后第7天和第21天，处理T1、T2和T3的大豆叶片POD活性显著高于CK，且随土壤微塑料含量增加而增加。CAT活性在3个采样时期呈现出先升高后降低的趋势（图4C），同一取样时期，处理间表现出随土壤微塑料含量增加先升高后降低的趋势，T2处理大豆叶片CAT活性最高。

图4 微塑料对大豆幼苗超氧化物歧化酶（A）、过氧化物酶（B）和过氧化氢酶（C）活性的影响Figure 4 Effects of microplastics on the activity of SOD(A)，POD(B)and CAT(C)in soybean seedlings

除出苗后第14天时T3处理的MDA含量与CK无显著差异外（图5A），处理T1、T2和T3在大豆出苗后第7、14和21天的MDA含量均显著低于CK（P＜0.05）。值得关注的是，在出苗后第7天，随着微塑料添加量的增加，大豆叶片的MDA含量呈梯度下降趋势，处理T1、T2和T3较对照CK分别降低了23.5%、34.1%和37.9%。

由图5B可知，大豆出苗后第7天，处理T1、T2和T3的可溶性蛋白含量与CK均无显著差异。大豆出苗后第14天，处理T1的可溶性蛋白含量显著低于CK（P＜0.05）。在出苗后第21天，处理T2大豆叶片的可溶性蛋白含量显著高于CK和T1（P＜0.05），高浓度处理T3大豆叶片可溶性蛋白含量显著低于CK、T1和 T2处理（P＜0.05）。

图5 微塑料对大豆幼苗丙二醛（A）和可溶性蛋白（B）含量的影响Figure 4 Effects of microplastics on the contents of malondialdehyde(A)and soluble protein(B)in soybean seedlings

3 讨论与结论

微塑料是一种全球性的污染物，它们小到可以被多种生物吸收，甚至可以跨越一些生物屏障。在水生系统中，微塑料已经成为藻类、苔藓虫、甲藻、等足类、海洋蠕虫和微生物的浮动栖息地[16]，并通过食物链传递对水生生物造成毒害。然而，目前有关微塑料对土壤-植物系统毒性的研究报道较少，其对陆地植物的作用机理也尚不清楚[17]。本研究发现，随土壤中微塑料含量的增加，大豆苗期的表观生长呈现出胁迫现象，这与Qi Y.L.等[18]发现塑料残留物对农作物的生长造成不良影响的结果一致。徐荣乐等[19]研究发现，农膜残留明显阻碍了植物根系对必需营养元素和水分的吸收，导致植物新陈代谢的需求得不到满足。本研究中，高梯度微塑料添加量处理下，大豆根系活力明显受到抑制；尽管中低浓度处理下不良影响效应减小，但仍低于空白对照。G.Kalˇíková 等[20]发现 30～600 μm 的 PE 微珠可以通过机械阻断对浮萍的根系生长造成显著影响。环境中的微塑料颗粒形状各异、边缘粗糙，可能会对根尖造成如细胞壁破损等机械损伤，破坏细胞结构的完整性从而导致根细胞活性降低，且这种机械损伤随着微塑料浓度的增加会越来越严重[20]。由此推测本研究中15 μm mPVC可能是因为通过吸附在大豆根系细胞壁孔洞，扰乱根系对水分和养分的正常运输或吸收，从而导致大豆生长受抑。

叶绿素是植物光合过程的主要参与者，高等植物叶绿素主要包括叶绿素a和叶绿素b两种，它们在植物的生长代谢中不断合成和分解。在不利条件下，叶绿素a/b值的变化可以理解为植物为抵御不良环境进行的一种自我保护[21]。由图3A可知，大豆出苗后第7天，各处理的叶绿素a/b值与对照CK无显著差异，表明微塑料在短期内对大豆幼苗光合效率影响不大，这与M.C.Alicia等[22]对浮萍的七天暴露试验研究结果一致。然而，通过对大豆出苗后第21天叶绿素含量的研究发现，各处理的叶绿素含量呈低抑制中高恢复的趋势（图3B），其原因可能是大豆对微塑料的吸附与吸收主要取决于微塑料颗粒本身的性质[23]。在中高浓度下，微塑料不断团聚，团聚后的微塑料颗粒粒径逐渐增大、成为吸附的主要阻碍因素[24]，降低了大豆与微塑料的接触性，从而减轻了其光合胁迫。

SOD、POD、CAT、MDA 和可溶性蛋白等生理生化参数可以作为反映植物对微塑料胁迫下毒理学反应的良好指标[25]。通常，如果生物体的活性氧（ROS）水平超过它的抗氧化活性，就会引起生物细胞脂质的过氧化反应，导致细胞膜磷脂双分子层塌陷、细胞扭曲变形，使细胞的物质能量交换等生长代谢活动受到影响[26]。Sun X.等[9]研究表明＜200 nm 的聚苯乙烯纳米级塑料颗粒可被拟南芥根系吸收，导致根细胞中H2O2和O2-含量增加，对根系及地上部植株生长造成不良影响。为对抗ROS的不良影响，植物会产生一系列用于消除ROS的抗氧化酶和抗氧化剂[27]，其中超氧化物歧化酶（SOD）可催化超氧化物自由基，将其歧化为 H2O2和O2，是清除ROS的第一道防线，CAT和 POD能将H2O2歧化为 H2O和O2，保护膜结构。本研究中，微塑料浓度的升高在大豆出苗初期显著提高了大豆体内抗氧化酶SOD的活性（图 4A），POD 和 CAT活性（图 4B、4C）也随土壤微塑料残留量增加表现出升高的趋势，因此促进了大豆抗氧化系统运转，从而减少了活性氧ROS的积累，降低外界的胁迫与毒害效应。这与水体中无脊椎动物在受到微塑料胁迫时激发体内抗氧化系统，从而减少氧化损伤的研究结果一致[28]。同时，大豆幼苗叶片中的MDA含量在出苗初期随土壤微塑料浓度升高显著下降（图5A），说明上述大豆对土壤微塑料残留胁迫表现出的氧化应激反应减轻了其细胞膜脂质的过氧化程度。目前微塑料对高等植物的研究较少，但与微塑料类似，纳米级金属颗粒也存在对植物的潜在生理毒性，研究表明在菠菜叶面喷施纳米TiO2显著提高了植株SOD、POD等抗氧化酶含量，降低了氧化自由基和MDA含量[29]，与本研究表现出的趋势相同。在大豆出苗中后期，叶片中SOD活性逐渐降低，CAT活性先升高后降低，这极有可能是因为随着幼苗的生长发育，大豆的生命力不断增强、合成蛋白质的速率逐渐加快（图5B），产生了大量的营养物质和酶来调节大豆的正常生理活动[30]，致使土壤中微塑料颗粒对其胁迫作用减弱。尽管大豆自身的抗氧化系统能在一定程度上缓解土壤微塑料残留带来的生理毒性胁迫，但在高残留浓度下，随生育时期延长，大豆的根系活力与对照相比依旧显著降低。

综上所述，本研究结果表明中高浓度（1.62～2.70 g/kg）微塑料（15 μm mPVC）残留土壤显著抑制大豆幼苗的叶面积、株高和根鲜重（大豆出苗后第7天和第14天），随着植株生长时间的延长（出苗后第21天），微塑料对大豆的生长影响逐渐减弱。高浓度（2.70 g/kg）mPVC显著抑制大豆的根系活力。随着mPVC添加量的升高，大豆幼苗体内抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性升高，表明大豆可通过自身抗氧化酶体系的调解减轻微塑料造成的胁迫。但在实际生产中，应加强对农田中农膜的回收，以减少土壤微塑料残留量，降低其对农作物生长发育的影响。