冠菌素对番茄防御基因表达、胼胝质沉积及细菌生长的影响

张镇川，何 冰，李 甜，靳亚忠，耿雪青*

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.西宁市农产品质量安全检测中心，西宁 810016；3.黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，黑龙江大庆 163319）

番茄（Solanum lycopersicum）是一种在世界范围内广泛种植的蔬菜作物。番茄病害会严重影响番茄果实的产量和品质，制约了番茄产业的发展。番茄细菌性斑点病是一种严重的细菌性病害，主要危害番茄植株的叶片、茎和果实，造成5%～75%的减产，同时影响果实的外观[1]。近年来，我国广西等地有该病害爆发的报道，发病率高达80%[2]。鉴于其严重的危害性，该病害已被列入我国的出入境检疫有害生物名录[1]。

丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas syringae pv.tomato是番茄细菌性斑点病的致病菌，冠菌素（coronatine，COR）是其分泌的一种化合物[3]。黄化症状是番茄细菌性斑点病发展后期的典型病状，外源COR处理能够诱导番茄叶片变黄，表明COR作为致病因子在病害发展过程中发挥重要作用[4]。COR的分子式为C18H25NO4，由冠烷酸（CMA）和冠菌酸（CFA）通过酰胺键缩合而得[5]。冠烷酸与乙烯合成前体1-氨基环丙烷-1-羧酸酯（ACC）结构类似，而冠菌酸与茉莉酸（JA）结构相似[6]。COR与茉莉酸异亮氨酸（JA-Ile），都能与宿主细胞上的茉莉酸受体蛋白COI1特异结合[7]。

植物内源激素在植物防御反应中发挥着重要作用，乙烯[8]、茉莉酸[9]和水杨酸[10]是参与植物防御的关键激素。乙烯和茉莉酸在抵抗死体营养病原体上发挥着协同作用，而水杨酸主要介导植物抵抗半活体营养病原菌和活体营养病原体的防御反应[11]。EIN2是一种跨膜蛋白，其半衰期很短，是乙烯信号通路的正调节因子[12]。EIN3也是乙烯信号通路的正调节因子，定位于细胞核中，是EIN2的下游调节蛋白，作为转录因子激活乙烯响应基因的转录[13]。脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）催化亚麻酸氧化生成13-氢过氧化亚麻酸，该反应是茉莉酸生物合成的第一步反应，因此LOX对于茉莉酸的生物合成至关重要，其编码基因LoxD常被作为茉莉酸通路标记基因[14]。MYC2转录因子是茉莉酸信号通路的重要蛋白，能够激活茉莉酸信号传导途径[15]。病程相关蛋白PR1a由水杨酸诱导产生，被用作水杨酸信号通路的标记蛋白[16]。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）是苯丙烷代谢途径的关键酶，木质素、酚类、黄酮类等多种次级代谢产物是通过苯丙烷代谢途径生成的，这些次级代谢产物在植物防御中发挥着重要作用，因此PAL是植物体内的重要防御酶[17]。

植物叶片是病原细菌危害植物的主要组织，细菌生长能力测定可以反映不同菌株在植物组织中的寄生能力，进而判断菌株的毒性[3]。植物在病原菌入侵时会激活自身的防御反应，胼胝质介导的细胞壁增强是一种常见的基础防御。接种病原细菌到叶片中数小时后，可以在接种叶片的细胞壁和细胞膜之间观测到胼胝质沉积[18]。

目前国内外对COR的研究主要集中在模式植物拟南芥上，而COR在番茄植株上的生理功能及其在细菌致病过程中发挥的作用还不是很清楚。本试验通过RT-qPCR技术测定不同浓度COR处理之后的番茄叶片的防御基因表达量，揭示了不同浓度下COR的生理功能；通过细菌生长曲线和胼胝质沉积数量的测定，并结合基因表达量的分析结果，证明了丁香假单胞菌分泌的COR能够促进细菌的毒性，初步探索了COR促进病原菌毒性增强的机理，为番茄细菌病害防控提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

①植物：以感病番茄品种“Money maker”为试验材料，种子来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所馈赠。

②菌株：野生型致病菌P.syringae pv.tomato DC3000（以下简称Pto）和不能产生COR的突变体cor-，以上菌株均来源于美国俄亥俄州立大学Dr.Daivd Mackey实验室馈赠。Pto菌株携带利福平抗性，cor-菌株携带利福平抗性和卡那霉素抗性。

③试剂：冠菌素（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）；Trizol试剂（上海厚凯生物科技有限公司）；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（日本宝生物公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本宝生物公司）；苯胺蓝（国药集团化学试剂有限公司）；苯酚（上海泰坦科技股份有限公司）；乳酸（上海凌峰化学试剂有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；配置KB培养基试剂：蛋白胨、磷酸氢二钾、甘油和硫酸镁（国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（上海泰坦科技股份有限公司）；氯化镁（国药集团化学试剂有限公司）；利福平（上海凌峰化学试剂有限公司）；卡那霉素（上海贤鼎生物科技有限公司）。

1.2 植物和细菌培养

将番茄种子于55℃水浴中浸泡催芽，待种子出芽之后播种至穴盘中，将草炭∶蛭石∶珍珠岩以3∶1∶1的比例均匀混合为培养基质。将穴盘放于恒温光照培养箱中进行培养，培养条件为：25℃恒温光照12 h，18℃恒温黑暗12 h。待幼苗长至2叶1心后，移苗至盆中放于恒温光照培养箱中培养。幼苗长至5叶1心后选取长势相当的健康植株用于试验。

将Pto接种至含有利福平（50 μg/mL）的KB固体培养基中；将cor-接种至含有卡那霉素（100 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的KB固体培养基中。平板倒置于28℃恒温培养箱中，培养14～16 h。

1.3 番茄叶片的COR处理

将 COR溶解配置为 1 μmol/L（高浓度）、0.1 μmol/L（较高浓度）、0.01 μmol/L（较低浓度）、0.001 μmol/L（低浓度）4个浓度的COR溶液，选取第3、4片复叶中较大的5片小叶进行处理，用1 mL无菌注射器（去注射器针头）将不同浓度COR溶液注射进番茄叶片中，每片小叶注射溶液量约为1 mL，以去离子水作为对照组，每个组至少处理15片小叶。24 h后取样，用液氮速冻叶片之后存放于-80℃冰箱中用于后续实验。

1.4 基因表达差异分析

将COR处理后的番茄叶片于液氮中研磨至粉末状，取100 mg混合均匀的样品，采用 Trizol法提取总RNA[19]。利用反转录试剂盒将总RNA反转录得到cDNA。利用Primer 5设计7对引物（表1），测定不同处理下叶片中的 PR1a、LoxD、MYC2、EIN2、EIN3和PAL5基因的相对表达量，以番茄Actin基因作为内参基因。在CFX96实时荧光定量分析仪（Bio-Rad上海有限公司）上进行RT-qPCR反应。反应程序为：95℃预变性30 s，反应循环“95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s”，共设置40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量[20]。本次试验设置3次生物学重复。

1.5 细菌生长能力测定

用10 mmol/L MgCl2溶液将KB固体培养基上活化培养的细菌菌落重悬，稀释菌液直至OD600=0.2。将OD600=0.2的菌液（浓度为1×108CFU/mL）稀释1 000倍，用1 mL无菌注射器注射菌液到叶片中，每片小叶注射菌液量约为1 mL，72 h后用打孔器随机在接种过细菌的叶片上打孔取样，每个处理取9个叶圆片，用研磨仪研磨叶片，梯度稀释菌液之后取10 μL菌液滴于KB固体培养基上，待菌液自然挥发之后倒置于28℃培养箱中进行培养48 h。选取 CFU（Colony-Forming Units）在 20～100 范围内的梯度进行计数，每个梯度至少3次计数后取平均值计数。本实验设置3次生物学重复。

1.6 胼胝质沉积分析

用1 mL无菌注射器注射OD600=0.2的菌液到叶片中，每片小叶注射菌液量约为1 mL，以10 mmol/LMgCl2溶液作为对照。以水∶甘油∶苯酚∶乳酸∶乙醇=1∶1∶1∶1∶2 的体积比配置脱色液，胼胝质是一种相对较晚的植物防御指标，在接种细菌到叶片15 h后能够在叶片中被观测到，我们将处理15 h后的叶片浸没在脱色液中过夜脱色。用去离子水和50%乙醇交替冲洗叶片3次，采用0.01%水溶性苯胺蓝将叶片胼胝质染色，染色时间为30 min。染色结束后用去离子水洗去叶片上的染液，移到载玻片后制成叶片标本放于荧光显微镜紫外波长下观察，保存图像。采用Image J软件统计胼胝质沉积数量。每个处理组取至少取5片叶片进行观察，每片叶片至少选取3个不同视野区域进行统计。本实验设置3次生物学重复。

表1 RT-qPCR分析引物Table 1 Primers used in RT-qPCR analysis

1.7 数据处理

使用IBM SPSS Statistic 20进行差异显著分析，采用Excel软件绘图。

2 结果与分析

2.1 COR处理番茄叶片后基因表达分析

2.1.1 乙烯信号途径相关基因的相对表达量

从图1中可以看出，所有处理组中的EIN2基因和EIN3基因的表达量均显著高于对照组。对于EIN2基因来说，各处理组中表达量最高的为1 μmol/L组，相对表达量最低的为 0.001 μmol/L 组，1 μmol/L 组的表达量显著高于 0.1 μmol/L组，0.01 μmol/L组，和 0.001 μmol/L 组。0.1 μmol/L 组，0.01 μmol/L 组和0.001 μmol/L浓度的COR诱导EIN2没有显著差异。与EIN2基因表达类似，EIN3基因相对表达量最高的处理组为1 μmol/L组，显著高于其他3个处理组，表明COR在高浓度时对EIN2基因和EIN3基因具有较强的诱导作用。

图1 不同浓度COR处理下乙烯相关基因的表达水平Figure 1 The expression level of ethylene-related genes under different COR concentration of treatment

2.1.2 茉莉酸合成和信号途径相关基因的相对表达量

从图2可以看出，除0.1 μmol/L外，其他处理组中的LoxD基因和MYC2基因的表达量均与对照组差异显著，且同一处理组中两个基因的变化趋势相同。1 μmol/L COR处理组中的LoxD基因和MYC2基因的表达量显著高于对照组，表明高浓度COR能够诱导番茄叶片表达LoxD基因和MYC2基因。0.01 μmol/L COR 处理组和 0.001 μmol/L COR 处理组中的LoxD基因和MYC2基因的表达量显著低于对照组，表明低浓度和较低浓度COR处理抑制了番茄叶片LoxD基因和MYC2基因的表达。

图2 不同浓度COR处理下茉莉酸相关基因的表达水平Figure 2 The expression level of jasmonic acid-related genes under different COR concentration of treatment

2.1.3 PR1a基因的相对表达量

从图3中可以看出，除1 μmol/L处理组外，其余各处理组PR1a基因的表达量均低于对照组，其他处理组与对照组间差异显著，0.1 μmol/L处理组分别与0.01 μmol/L和0.001 μmol/L处理组均无明显差异，而0.01 μmol/L和0.001 μmol/L处理组差异显著，整体来说COR能够抑制叶片PR1a基因的表达。0.01 μmol/L处理组的PR1a基因表达量在4个处理组中最低，仅为1 μmol/L处理组的0.24倍，较低浓度COR对PR1a基因表达的抑制作用最强。

图3 不同浓度COR处理下PR1a基因的表达水平Figure 3 The expression level of PR1a gene under different COR concertation of treatment

2.1.4 PAL5基因的相对表达量

从图4中可以看出，各浓度COR处理番茄叶片均能诱导 PAL5 基因的表达。1、0.1、0.01、0.001 μmol/L处理组的PAL5基因平均相对表达量分别为307.11、241.76、169.35 和 171.39。0.1 μmol/L 处理组分别与1 μmol/L和0.01 μmol/L处理组之间无明显差异，0.01 μmol/L 处理组和 0.001 μmol/L 处理组无明显差异。总的来说，随着COR浓度的增高，PAL5基因的表达量呈上升趋势。

图4 不同浓度COR处理下PAL5基因的表达水平Figure 4 The expression level of PAL5 gene under different COR concertation of treatment

2.2 细菌生长能力测定

从图5中可以看出，野生型菌株Pto在番茄叶片中的生长能力极显著高于COR缺失突变体cor-。同一接种浓度下接种不同菌株72 h后，叶片中Pto的种群密度为7.32×107CFU/cm2，cor-的种群密度为1.44×107CFU/cm2，Pto的种群密度约为cor-的5倍，表明病原菌不能分泌冠菌素后，病原菌的生长量明显减少，说明COR能够促进病原菌在宿主植物中的生长。

图5 不同菌株生长能力测定Figure 5 Determination of growth ability of different strains

2.3 胼胝质沉积分析

胼胝质是植物抵御病原菌入侵的物理屏障。从图6中可以看出，处理组诱导的胼胝质沉积数量极显著高于对照组，同时Pto处理组的胼胝质沉积数量极显著低于cor-处理组。荧光染色叶片观测结果表明，接种细菌之后，番茄叶片启动诱导胼胝质沉积的基础防御，而COR促进细菌一定程度上抑制胼胝质沉积，从而抑制植物防御。

图6 不同处理诱导的胼胝质沉积Figure 6 Callose depositions induced by different treatments

3 讨论与结论

COR是P.syringae pv.tomato分泌的一种化合物，其分子结构同茉莉酸衍生物茉莉酸异亮氨酸极其相似。茉莉酸异亮氨酸是植物激素茉莉酸的生物活性物质，茉莉酸以茉莉酸异亮氨酸的活性形式同受体蛋白COI结合从而激活茉莉酸信号转导途径[7]。COR是病原菌分泌的毒性因子，作为茉莉酸异亮氨酸的结构类似物，在番茄中与受体蛋白COI1的亲和力高于茉莉酸异亮氨酸，在植物激素途径中发挥着与茉莉酸相似的调节作用[4，7]。Uppalapati等[4]对冠菌素、冠烷酸、冠菌酸和茉莉酸甲酯的作用进行了研究，发现COR相较于冠菌酸和冠烷酸具有更强的生物活性，茉莉酸甲酯诱导基因中有大约40%的基因也能被COR诱导表达。

本试验利用RT-qPCR技术测得不同浓度COR处理条件下茉莉酸、水杨酸、乙烯相关基因以及PAL5的相对表达量。对于茉莉酸相关基因来说，不同的COR注射浓度会呈现出不同的调节作用，高浓度的COR处理上调表达了MYC2基因和LoxD基因，低浓度和较低浓度的COR处理会导致番茄叶片MYC2基因和LoxD基因的下调表达。在健康的植物中存在着低水平的茉莉酸，这些茉莉酸能够诱导JAZ阻遏蛋白的表达，而JAZ蛋白能够抑制下游的茉莉酸信号通路[21]。因此，低浓度COR可能诱导了茉莉酸的负反馈调节，从而下调表达了MYC2基因和LoxD基因。PAL是一种重要的植物防御酶，在本试验中，PAL5基因的表达量在各浓度COR处理的诱导下显著提高，表明COR具有诱导PAL表达的生理功能。外源茉莉酸甲酯施用到植株上能够诱导LjPAL1基因的表达[22]。PAL活性同内源茉莉酸水平呈显著正相关，高活性PAL的植株对死体营养菌尖刀镰孢菌的抗性增强[23]。因此，高浓度COR对PAL5基因的诱导作用可能来源于COR诱导的茉莉酸信号通路。但在低浓度和较低浓度时，COR在抑制了茉莉酸相关基因的表达的同时诱导PAL5基因的大量表达，说明COR对PAL5基因的诱导作用存在不依赖于茉莉酸途径的其他作用途径。本试验中，各浓度COR处理均导致了番茄叶片中PR1a基因的下调表达，而诱导了EIN2基因和EIN3基因的表达，表明COR具有抑制番茄体内水杨酸信号途径和激活乙烯信号途径的功能。

植物在逆境条件下激活激素介导的防御反应是极其耗能的，为了避免过量的防御转录反应影响自身的营养生长，植物在识别出不同的病原体后会采用一种特定的防御途径[24]。不同激素信号通路之间的相互交叉作用为植物平衡生长和防御的能量分配提供了可能性。通常情况下，茉莉酸和乙烯信号途径通过MYC2和EIN3协同诱导下游防御基因PDF1.2的表达，增强植物对死体营养病原菌的抵抗性，而水杨酸则介导对活体营养和半活体营养病原菌的广谱抗性[25]。茉莉酸信号通路和水杨酸信号通路之间主要表现出拮抗作用。MYC2转录因子能够与NAC转录因子的启动子结合，激活NAC转录因子的转录，NAC转录因子的基因抑制了水杨酸生物合成相关酶ICS的表达，同时上调表达了能够诱导水杨酸失活的苯甲酸/水杨酸羧甲基转移成酶的表达，进而抑制水杨酸的合成和积累[26]。丁香假单胞菌是一种半活体营养病原菌，植物对丁香假单胞菌的防御反应依靠水杨酸信号通路。S.Panchal等[27]比较了夜间环境下Pto处理叶片和外源COR处理叶片的气孔开口宽度差异，发现Pto分泌的COR与1.5μmol/L浓度外源COR处理诱导的气孔开口宽度相当，由此可以假设细菌侵染过程中产生的COR生物浓度为1.5 μmol/L，该浓度与本次试验中的高浓度梯度相当。本研究结果表明高浓度COR能够激活乙烯和茉莉酸信号通路相关基因的表达而抑制水杨酸信号途径相关基因的表达，因此，推测在丁香假单胞菌侵染过程中，细菌通过分泌高浓度的COR劫持乙烯/茉莉酸途径，进而削弱依赖于水杨酸的植物防御反应。

分别接种Pto和cor-到番茄叶片中，一定时间后取样检测番茄叶片中的细菌生长，结果显示能够分泌冠菌素的野生型菌株Pto在叶片中的生长能力远强于不能分泌冠菌素的突变株cor-，表明COR增强了细菌在叶片中的寄生能力，从而增强了细菌致病性。胼胝质是一种无定型的高分子量β-1,3-葡萄糖聚合物，能够在病原体侵染早期在入侵部位沉积，形成有效的物理屏障，增强植物的细胞壁防御[28]。通常认为，胼胝质沉积是由病原体相关分子模式触发引起的植物防御，用纯化的丁香假单胞菌鞭毛蛋白的保守肽flg22处理叶片可以诱导胼胝质沉积[29]。病菌通过一些效应蛋白因子作用于宿主植物，能够抑制胼胝质沉积，比如flg22激活的胼胝质沉积就受到丁香假单胞菌分泌的效应蛋白的抑制[29]。本试验中的胼胝质染色观测结果显示，相较于对照处理，野生型菌株Pto和突变株cor-均能显著诱导番茄叶片的胼胝质沉积，但Pto诱导的胼胝质沉积数量显著少于cor-诱导的胼胝质沉积，表明COR也能够抑制植物胼胝质沉积。

综上，本研究揭示不同浓度COR对番茄叶片防御基因的调节作用，各浓度的COR处理均能激活乙烯信号传导途径，且高浓度时这种诱导效应最强；COR处理激活了PAL5基因的表达，抑制了PR1a基因的表达；COR在高浓度时会促进番茄茉莉酸合成和信号传导，而在低浓度时抑制茉莉酸相关基因的表达。本研究结果证明了COR在丁香假单胞菌侵染过程中发挥着重要作用。一方面，细菌可能通过分泌高浓度的COR，促进了乙烯/茉莉酸途径，以此拮抗水杨酸途径；另一方面，细菌分泌的COR能够显著减少叶片中的胼胝质沉积数量。因此，COR作为一种毒性因子促进细菌削弱了宿主防御，从而促进病原菌的生长。