水孔蛋白-5在机械通气致急性肺损伤大鼠肺组织中的表达研究*

陈美羽，赵毓静，张新日

（山西医科大学第一医院 呼吸与危重症学科，山西 太原030001）

慢性阻塞性肺疾病、哮喘、呼吸衰竭等疾病是呼吸系统常见病，临床通过机械通气进行呼吸支持治疗，维持患者血氧饱和度。但机械通气时间过长，通气量过大，可出现机械通气相关性肺损伤，对肺组织造成二次打击，严重时可导致急性肺损伤（acute lung injury, ALI）或急性呼吸窘迫综合征发生。ALI 主要病理生理特征是弥漫性肺泡水肿和肺泡液清除率下降，肺泡上皮细胞损伤和肺毛细血管内皮细胞通透性升高，肺泡腔内富集含蛋白和炎症细胞因子的水肿液，破坏肺泡细胞表面气液交换屏障的平衡，导致急性呼吸窘迫综合征发生[1-2]。

水孔蛋白-5（Aquaporin-5, AQP-5）位于Ⅰ型肺泡上皮细胞，是调节水分子转运的功能性蛋白，生理状态下可协助清除肺泡腔内多余水分，保持肺泡腔干燥环境[3]。但AQP-5 在ALI 过程中对水肿液清除作用的机制仍不明确。多项研究显示[4-7]，不同类型损伤因素致ALI 条件下，AQP-5 表达趋势不稳定。本研究通过大潮气量机械通气快速复制大鼠ALI 模型[8]，观察在不同的机械通气时间下，AQP-5 在肺组织中表达的变化，探讨其在机械通气致ALI 中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠30只，体重270～320 g，均由山西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号[SCXK（晋）2015-0001]。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗鼠AQP-5 一抗（武汉博士德生物公司，编号：BA2205），SABC 免疫组织化学染色试剂盒[即用型SABC-POD（兔IgG），武汉博士德生物公司，编号：SA1022]，RWD407 型小动物呼吸机（深圳瑞沃德公司）。

1.3 方法

将30 只大鼠按照不同的机械通气时间，完全随机分为对照组、0.5 h 组、1.0 h 组、1.5 h 组和2.0 h组，每组6只。适应性饲养1 周，实验前12 h 禁食，自由饮水。大鼠称重并记录，用于计算麻醉剂量和肺系数。水合氯醛（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧位置于小动物实验台上，颈前剪毛备皮消毒，沿颈部正中纵向切开约1.5 cm，逐层钝性分离皮肤及皮下肌肉组织，暴露气管。

对照组大鼠行气管切开，保持气道通畅，自由呼吸室内空气（吸氧浓度21%），不给予机械通气。2 h 后行常规胸、腹部消毒，逐层打开腹腔并暴露腹主动脉，迅速放血处死，处置方法符合动物伦理学标准。快速打开胸腔，钝性分离组织取出肺脏，立即置于预冷的生理盐水中漂洗2、3 次，用无菌纱布吸干肺表面水分。留取肺大体标本，用于观察肺组织大体形态损伤程度；取右肺称湿重，用于计算肺系数，评估肺组织水肿程度；取左肺于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后进行HE 染色和免疫组织化学染色，光镜下观察肺组织损伤程度和检测各组肺组织中AQP-5 的表达。

0.5 h 组、1.0 h 组、1.5 h 组和2.0 h 组大鼠行气管切开后连接小动物呼吸机，呼吸室内空气（吸氧浓度21%），分别给予机械通气0.5 h、1.0 h、1.5 h 和2.0 h，4组呼吸机参数设置一致：VT=30 ml/kg，I∶E为1∶1，PEEP为0 cmH2O，RR为60次/min。4 组大鼠机械通气结束后立即处死留取标本，处置方法同对照组大鼠。

1.4 观察指标

1.4.1 HE 和免疫组织化学各组大鼠肺组织经过多聚甲醛固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明石蜡包埋冷却，制成4 μm 厚切片，过夜烤片。HE 染色：二甲苯、酒精梯度进行组织脱蜡，苏木精-伊红染色，酒精、二甲苯梯度脱水，风干后树胶封片，光镜下观察各组肺组织损伤程度。免疫组织化学：组织脱蜡，枸橼酸盐高压抗原热修复，5%BSA封闭液封闭，孵育兔抗鼠AQP-5 一抗（1∶100）37℃1 h，SABC 免疫组织化学染色试剂盒二抗孵育，DAB 显色，苏木精复染，封片，光镜下观察并评估各组肺组织中AQP-5 的表达。

1.4.2 肺系数通过肺系数显示肺组织水肿损伤程度。分别称量机械通气前大鼠体重和右肺组织重量，计算肺系数：肺湿重（g）/体重（kg）×100%，肺系数越大表示肺水肿程度越严重。

1.4.3 AQP-5 免疫组织化学染色结果判定方法采用染色强度评分和AQP-5 阳性细胞占比评分[9]判定AQP-5 染色结果。每组取6 张切片，每张切片随机选择3 个视野，以肺泡上皮细胞顶膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。首先按照染色强度评分：棕褐色为3 分，棕黄色为2 分，浅黄色为1 分，无色为0 分；再按阳性细胞占视野内细胞的百分比评分：＞75% 为4 分，75%～＞50% 为3 分，50%～＞10%为2分，≤10%为1分，阴性为0分。评分越高表示肺组织中AQP-5表达越多。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，相关分析用Spearman法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织大体标本

对照组大鼠肺组织大体标本体积正常，表面光滑，色泽粉嫩，质软（见图1A）；与对照组比较，0.5 h组、1.0 h 组、1.5 h 组和2.0 h 组大鼠肺组织体积增大，肺叶边缘外翻，有弥漫性出血，质韧（见图1B～E 中箭头所示）。表明机械通气时间的延长对肺组织大体形态改变有影响。

图1 各组大鼠肺组织大体标本

2.2 各组大鼠肺系数比较

各组大鼠肺系数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，1.0 h 组和1.5 h组大鼠肺系数差异无统计学意义（P＞0.05）；其余各组大鼠肺系数组间两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠肺组织HE染色结果

对照组大鼠肺泡腔大小正常，形态规整，肺泡壁完整、无炎症细胞浸润，肺间质无水肿（见图2A）；与对照组比较，0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组和2.0 h组大鼠肺泡壁可见不同程度破裂、肺大泡形成，肺泡腔内有红细胞及粉红色水肿液渗出，肺间质水肿、炎症细胞浸润（见图2B～E 中箭头所示），为典型ALI 病理形态学特征，表明机械通气致大鼠ALI 模型复制成功。

2.4 各组大鼠肺组织免疫组织化学染色结果

对照组大鼠肺组织染色均匀一致、呈棕褐色（见图3A）；与对照组比较，0.5 h 组、1.0 h 组、1.5 h 组和2.0 h 组大鼠肺组织染色不均匀，呈现棕黄色、浅黄色，AQP-5 表达逐渐减少甚至无（见图3B～E 中箭头所示）。表明机械通气时间对肺组织中AQP-5 表达有显著影响。

表1 各组大鼠肺系数比较 （n=6，±s）

表1 各组大鼠肺系数比较 （n=6，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与0.5 h组比较，P ＜0.05；③与1.0 h组比较，P ＜0.05；④与1.5 h组比较，P ＜0.05。

肺系数组别1.18±0.035 2.24±0.119①3.33±0.072①②3.41±0.202①②4.03±0.200①②③④376.693 0.001对照组0.5 h组1.0 h组1.5 h组2.0 h组F 值P 值

图2 各组大鼠肺组织病理切片HE染色图 （×100）

图3 各组大鼠肺组织病理切片免疫组织化学染色图 （×100）

2.5 各组大鼠肺组织AQP-5 免疫组织化学染色强度评分与阳性细胞占比评分比较

各组大鼠肺组织AQP-5 免疫组织化学染色强度评分和AQP-5 阳性细胞占比评分比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，1.0 h 组和1.5 h 组AQP-5 染色强度评分和AQP-5阳性细胞占比评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；其余各组AQP-5 染色强度评分和AQP-5 阳性细胞占比评分两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.6 肺系数与AQP-5 免疫组织化学染色强度评分和阳性细胞占比评分的相关性

肺系数与AQP-5 免疫组织化学染色强度评分呈负相关（rs=-0.925，P=0.001）；肺系数与免疫组织化学AQP-5 染色阳性细胞占比评分之间呈负相关(rs=-0.951，P=0.001）。

表2 各组大鼠肺组织免疫组织化学AQP-5染色评分比较（n=6，±s）

表2 各组大鼠肺组织免疫组织化学AQP-5染色评分比较（n=6，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与0.5 h组比较，P ＜0.05；③与1.0 h组比较，P ＜0.05；④与1.5 h组比较，P ＜0.05。

组别染色强度评分阳性细胞占比评分对照组0.5 h组1.0 h组2.50±0.13①1.40±0.26①②3.60±0.18①2.40±0.16①②1.5 h组2.0 h组F 值P 值2.80±0.11 1.30±0.18①②0.40±0.22①②③④207.522 0.001 3.80±0.13 2.20±0.19①②0.70±0.27①②③④216.311 0.001

3 讨论

水孔蛋白家族被发现以来，已有13 种AQPs 亚型，特异性分布于人体各器官组织中[10]。AQPs 的分子量约28 kD，是一种含有胞质N-始端和C-末端的跨膜通道蛋白，由H1～H6 6 个跨膜片段组成，两两间相互靠近，共形成A～E 5 个“环区”。B 区和E 区反向平行接近形成“沙漏模型”，即疏水孔。中心孔开关的活性由门控或细胞膜中AQPs 的丰度来调节，这种缩窄性空间构型决定了水孔的渗透选择性[11]。

在肺组织中，AQP-5 表达于Ⅰ型肺泡上皮细胞顶膜近换气侧，水分子的转移依赖跨肺泡上皮和肺微血管内皮细胞的渗透梯度完成[3,11]。MA[5]发现敲除AQP-5基因，肺泡透水性较生理状态下可降低10倍，表明AQP-5 介导肺泡上皮细胞的水分子跨膜转运机制。刘洋等[6]发现在不同潮气量机械通气中，大潮气量组肺组织中AQP-5 表达量下调，可能与肺水肿发生机制有关。可见，AQP-5 的表达与急性肺水肿互为因果，相互促进。PIRES-NETO等[7]研究结果显示，AQP-5 的表达量在不同病因致急性呼吸衰竭患者的肺组织中均增加，认为AQP-5 对肺损伤的反应可能随时间波动，并与肺损伤的强度和类型有关。本研究采用大潮气量机械通气诱导大鼠ALI，研究结果显示，与对照组大鼠相比，随着通气时间延长，各机械通气组肺组织体积逐渐增大，光镜下可见肺泡壁破裂、肺泡腔及肺间质内水肿液渗出、炎症细胞浸润等细胞形态学的损伤程度逐渐加重，肺系数逐渐升高，提示肺水肿程度逐渐增加；而AQP-5 在肺组织中的表达逐渐减少。相关性分析结果显示，肺系数与肺组织AQP-5免疫组织化学染色评分呈负相关。

FABREGAT 等[12]发现在低潮气量机械通气大鼠肺组织中，AQP-5表达随着暴露时间的延长而增加，肺水肿程度逐渐减轻，认为AQP-5 对肺组织有保护作用。在本研究中值得关注的是，1.0 h 组和1.5 h 组肺系数结果比较，差异无统计学意义，可以反映出在持续机械通气过程中，肺水肿加重程度呈现短暂的缓慢趋势。结合免疫组织化学结果，1.0 h 组和1.5 h 组AQP-5 染色强度评分比较，差异无统计学意义，AQP-5 在1.0 h 组和1.5 h 组肺泡上皮细胞膜的表达仅占对照组肺组织细胞的50%左右，这部分肺组织中的AQP-5 可能对肺泡水肿液清除存在代偿机制，减缓肺水肿的进一步发生。但这种代偿机制并非持续作用，随着通气时间延续到2 h，肺泡上皮细胞及血管内皮完整性破坏严重，AQP-5 表达下降，AQP-5 对水通量的调节超过正常转运限度，对肺水清除出现失代偿。由此可见，AQP-5 参与机械通气致肺水肿的发生、发展，对肺泡水肿液的及时清除和吸收起到关键作用。

综上所述，随着机械通气时间延长，肺水肿程度逐渐加重，肺组织中AQP-5 表达逐渐减少，表明AQP-5参与机械通气致肺水肿的发生、发展。