支气管哮喘患儿CHI3L1基因多态性与糖皮质激素疗效的关系研究

彭昊，龙博文，钟炜，李德优

（萍乡市妇幼保健院1.儿科，2. PICU，3.小儿呼吸内科，江西 萍乡337000）

支气管哮喘（以下简称哮喘）是一类进行性气道慢性炎症性疾病，多见于儿童和青少年群体[1]。2014年，全球哮喘防治创议将哮喘进一步纳入“异质性疾病”的范畴，认为多基因遗传因素对哮喘的发病具有十分重要的影响[2]。目前，临床上对哮喘患儿的治疗方式分为控制性治疗和缓解性治疗。其中糖皮质激素属于一线长期控制性药物，但是很多患儿对吸入性糖皮质激素治疗存在明显的个体差异性[3]，推测可能与个体的遗传学组成不同有关。近几年，随着药物遗传学理论的逐渐成熟，很多学者已经鉴定了多种与吸入性糖皮质激素疗效相关的糖皮质激素受体基因。2017年，ZHU 等学者[4]通过一项全基因组关联研究发现CHI3L1基因多态性与哮喘发生风险密切相关。几丁质酶样蛋白40（chitinaselike protein,YKL-40）是CHI3L1基因编码产物，参与气道炎症反应和重塑过程[5]。而且杨丽霞等学者[6]证实布地奈德可影响大鼠模型血清YKL-40 蛋白水平。因此笔者推测CHI3L1基因多态性可能通过影响炎症反应和气道重塑而影响哮喘的发展及糖皮质激素的疗效。鉴于CHI3L1基因多态性与哮喘易感性及气道炎症反应之间的密切关系，本研究以江西省萍乡市妇幼保健院就诊的汉族哮喘患儿为研究对象，探讨CHI3L1基因多态性与哮喘患儿接受吸入性糖皮质激素治疗6 个月后疗效的关系，为本地区哮喘患儿的个体化临床治疗提供药物遗传学标记及用药方案指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料

前瞻性收集2018年1月—2018年12月在萍乡市妇幼保健院儿科就诊的慢性中度持续期哮喘患儿130 例。其中，男性79 例，女性51；年龄2～12 岁，平均（6.45±2.29）岁。纳入标准：①符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）》[7]关于慢性中度持续期支气管哮喘的诊断标准；②哮喘严重程度≥3 级；③近4 周内无糖皮质激素局部或全身用药史；④由患儿家长或法定监护人签署知情同意书，并遵医嘱完成治疗和随访。排除标准：①近2 周内有呼吸道感染病史者；②合并感染性疾病、免疫系统疾病、支气管肺炎、呼吸衰竭、肺结核及先天性心脏病患儿；③对糖皮质激素禁忌者。另取同期在本院儿保科体检的健康儿童50例为对照组，均无哮喘或变应性疾病史。其中，男性25例，女性25例；年龄2～12 岁，平均（6.50±2.50）岁。哮喘患儿和对照组儿童的年龄、性别构成比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 治疗方案

哮喘组患儿给予常规对症治疗，包括止咳、化痰、解痉平喘、纠正酸碱平衡、维持电解质等，严重者可给予吸氧；除此以外，雾化吸入布地奈德混悬液（英国Astra Zeneca 公司，规格：2 ml∶1 mg，批号：8339000）0.5 mg和硫酸沙丁胺醇溶液（苏州葛兰素史克制药有限公司，规格：1 ml∶5 mg，批号：C629118），2次/d，10 min/次，连续治疗12周。

1.3 疗效观察

治疗12 周后，观察患儿喘息、咳嗽、哮鸣、气促、胸闷等临床症状改善情况，根据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）》[7]，评估患儿治疗结束后4 周内日间症状（＜6 岁：＞1 次/周；≥6 岁：＞2 次/周）、夜间憋醒或咳嗽症状、应急缓解药物使用次数（＜6岁：＞1次/周；≥6岁：＞2次/周）和活动能力。良好控制：症状完全缓解，偶发轻度发作且可自行缓解；部分控制：存在1、2 项上述临床症状；未控制：存在3、4 项上述临床症状。其中达到良好控制者视为疗效良好；部分控制者和未控制者视为疗效不良。

1.4 肺功能检查

治疗前和治疗12 周后，采用Master Screen Paed肺功能检测仪（德国JAEGER公司）检测哮喘患儿肺功能，包括第1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second,FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、FEV1/FVC。

1.5 CHI3L1基因多态性检测

采集所有受试儿童肘静脉血5 ml，置于依地酸二钠（EDTA-Na）抗凝管中，3 000 r/min 离心20 min分离血清和血细胞，将血细胞提取全血基因组DNA 并进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）分型检测。基因多态性检测方法：①采用全血基因组DNA 小量抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA。②采用紫外分光光度法对DNA 纯度和浓度进行检测。③反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，延伸30 s，共循环35 次，72℃继续延伸5 min，得到PCR 扩增产物，取8 μl PCR 扩增产物进行TaqMan-PCR 反应。反应体系配制：2 μl 10×Buffer，1 μl 特异性限制性内切酶，9 μl 去离子水，于37℃反应12～14 h。④将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。⑤将50 μl 测序样品送至上海生工生物工程有限公司进行纯化测序；并采用BLAST 软件进行同源序列分析。等位基因频率=（2×纯合子个体数+杂合子个体数）/（2×受试儿童）。按照Hardy-Weinberg 平衡法对群体代表样本进行分析。设计CHI3L1基因rs10399805、rs4950928、rs883125位点基因引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。见表1。

表1 CHI3L1基因rs10399805、rs4950928、rs883125位点基因SNP分析

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 软件统计。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验

经Hardy-Weinberg 平衡法检验，CHI3L1基因rs10399805、rs4950928、rs883125 3 个基因位点处于遗传平衡（χ2=0.174、1.125和0.073，P=0.843、0.554和0.942），具有群体代表性。

2.2 对照组与哮喘组儿童CHI3L1 基因SNP 位点的基因型分布频率

对照组与哮喘组CHI3L1基因rs10399805位点基因型分布频率比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组与哮喘组rs4950928 位点基因型分布频率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组CC 基因型分布频率高于哮喘组。对照组与哮喘组rs883125 位点基因型分布频率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P ＜0.05）；对照组GG 基因型分布频率低于哮喘组。见表2和图1。

表2 对照组与哮喘组儿童CHI3L1基因SNP位点基因型分布频率比较 例（%）

图1 CHI3L1基因SNP位点基因多态性检测

2.3 疗效良好组与疗效不良组患儿CHI3L1 基因SNP位点的基因型分布频率

所有130例慢性中度持续期哮喘患儿遵医嘱完成了本项研究，最后经检查，90 例（69.23%）患儿获得良好控制，作为疗效良好组；另40 例（30.77%）患儿获得部分控制或者未控制，作为疗效不良组。疗效良好组与疗效不良组CHI3L1基因rs10399805 位点基因型分布频率比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。疗效良好组与疗效不良组rs4950928 位点基因型分布频率比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；疗效良好组CC 基因型分布频率高于疗效不良组。疗效良好组与疗效不良组rs883125 位点基因型分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；效良好组GG 基因型分布频率低于疗效不良组。见表3。

表3 疗效良好组与疗效不良组患儿CHI3L1基因SNP位点基因型分布频率比较 例（%）

2.4 3组CHI3L1基因位点患儿治疗前后肺功能指标比较

rs10399805 位点TT 型、CT 型和CC 型患儿治疗前后FEV1、FVC、FEV1/FVC 的差值比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。rs4950928 位点CC 型、CG 型和GG 型患儿治疗前后FEV1、FVC、FEV1/FVC 的差值比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；CG 型和GG 型低于CC 型（P＜0.05），CG型低于GG型（P＜0.05）。rs883125位点CC型、CG 型和GG 型患儿治疗前后FEV1、FVC、FEV1/FVC 的差值比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），CC 型和CG型高于GG 型（P＜0.05）。见表4。

表4 3组CHI3L1基因位点患儿治疗前后肺功能指标的差值比较 （±s）

表4 3组CHI3L1基因位点患儿治疗前后肺功能指标的差值比较 （±s）

基因位点rs10399805 n FEV1/L FVC/L FEV1/FVC/%TT CT CC F 值P 值rs4950928 CC 73 9.12±1.87 9.04±1.23 11.87±2.01 CG GG F 值P 值rs883125 0.000 0.000 0.000 CC CG GG F 值P 值12 54 64 6.12±1.23 6.33±2.01 6.51±2.56 2.076 0.129 7.23±1.42 7.14±1.33 6.99±2.01 0.260 0.771 7.21±1.21 7.18±1.89 7.45±2.22 0.304 0.738 51 6 4.89±1.23 6.09±1.11 98.035 5.00±1.01 7.86±1.23 137.347 5.64±1.00 9.23±1.38 181.301 78 32 20 7.23±1.23 6.82±1.11 5.87±1.00 16.719 0.000 8.09±1.23 7.72±0.89 6.00±1.34 39.025 0.000 8.88±2.01 9.00±1.97 6.12±1.21 36.386 0.000

3 讨论

哮喘涉及的发病机制复杂，尤其是遗传易感性、环境暴露和炎症反应属于最重要的致病因素。随着遗传学和分子生物学研究的深入，越来越多的基因多态性被证实与哮喘密切相关[8-10]。例如，本院曾对100 例健康儿童和100 例哮喘患儿进行RORA基因多态性检测，发现rs11071559 和rs7164773 位点基因型分布频率和等位基因频率存在统计学差异，推断RORA基因多态性与哮喘的发生存在一定的关联[11]。另外李明基和陈敏等学者[12-13]通过Mass ARRAY-IPLEX 质谱阵列技术证实CHI3L1基因多态性可能是儿童哮喘发生的易感因素，而且由CHI3L1基因编码的YKL-40 蛋白有望成为评价哮喘患儿病情严重程度及监测病情变化的一个新标志物。但是国外也有研究证实CHI3L1基因与哮喘可能无关[14]。

本研究通过TaqMan-PCR 反应证实在萍乡市哮喘患儿中CHI3L1基因rs4950928 和rs883125 位点基因型分布频率与健康儿童不同，但是并未发现rs10399805 位点基因型分布频率的差异性分布，这与国外USEMANN 等学者[15]的研究结论不一致，据推测可能是因为纳入样本量、纳入标准不同，以及与种族、地域、环境、饮食等因素存在差异有关。随着基因多态性的发现，也为临床个体化治疗提供了新的思路。吸入性糖皮质激素是目前临床上哮喘患儿首选的长期控制药物，但是不同个体对激素的反应存在较大的差异，部分患儿即使长期规范使用或加大剂量使用吸入性糖皮质激素，仍然无法获得理想的临床缓解[16-18]。因此，从个体遗传因素方面寻找预测吸入性糖皮质激素反应敏感性的指标对实现个体化治疗和精准医疗具有重要意义。

CHI3L1基因位于人类染色体1q31～1q32，具有遗传高度保守性，可广泛表达于人类各组织中。有学者发现，CHI3L1基因在黏膜炎症细胞中表达明显上调[19]，而且由CHI3L1基因编码的YKL-40 蛋白在气道、心血管、神经、关节等相关炎症疾病中也发挥重要作用，可作为炎症疾病预防和治疗的新靶点[20-22]。而糖皮质激素的作用机制为抑制炎症基因转录，阻滞前炎症反应，进而减轻炎症细胞聚集、浸润、活化等[23]。因此笔者推测CHI3L1基因可能与糖皮质激素治疗后的气道反应性存在一定的关联。本研究首次发现，吸入性糖皮质激素治疗疗效良好组与疗效不良组患儿CHI3L1基因rs4950928 和rs883125 位点的基因型分布频率具有明显差异。在用药一致、疗程一致、且使用剂量为推荐剂量的前提下，疗效良好组患儿rs4950928 位点CC 基因型分布频率明显高于疗效不良组患儿，同时rs4950928 位点CG 基因型分布频率和rs883125位点GG 基因型分布频率明显低于疗效不良组患儿，从而证实了笔者之前的推测。肺功能检查是目前临床上用于评价哮喘严重程度的重要指标之一[24-25]，为了进一步证实CHI3L1基因多态性与吸入性糖皮质激素疗效的关系，笔者从肺功能改善角度发现，治疗前后CHI3L1基因rs4950928 和rs883125 位点不同基因型患儿FEV1、FVC、FEV1/FVC 的差值存在差异，例如rs4950928 位点CG 型和GG型患儿治疗前后FEV1、FVC、FEV1/FVC的差值低于CC 型，且CG 型低于GG 型；同时，rs883125 位点CC 型和CG 型患儿治疗前后FEV1、FVC、FEV1/FVC的差值高于GG 型。说明CHI3L1基因rs4950928 和rs883125位点基因多态性与肺功能有关，这可能也是影响糖皮质激素治疗疗效的原因之一。

综上所述，遗传因素在哮喘发生和治疗方面具有重要作用。通过对本院纳入的130例2～12岁慢性中度持续期哮喘患儿CHI3L1基因rs10399805、rs4950928、rs883125位点基因型进行分析，证实在萍乡市儿童中，CHI3L1基因rs4950928 和rs883125 位点基因多态性可能与哮喘易感性和吸入性糖皮质激素反应敏感性有关，对携带rs4950928 位点C/G 基因型和rs883125位点G/G基因型的患儿，建议选择其他药物代替糖皮质激素，以提高患儿的治疗效果。