千层纸素A 抗肿瘤机制的研究进展

周 聪，柴效科，宋爱琳

兰州大学附属第二医院，甘肃 兰州730030

黄芩Scutellaria baicalensis Georgi 是我国的传统中药材，在临床上应用广泛。千层纸素A（oroxylin A）是从黄芩根中提取的一种黄酮类化合物，具有广泛、强大的生物学活性，其中抗肿瘤效应近年来受到国内外学者的热切关注。千层纸素A 抗肿瘤活性表现为抑制癌细胞增殖、重建癌细胞代谢、诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭转移、逆转癌细胞对化疗药的耐药性等方面，作用的信号通路广泛且多层次。

千层纸素A，由SHAH、MEHTA、WHEELER 首先从木蝴蝶的根皮中分离而得［1］。千层纸素A 是一种黄色针状结晶，化学结构式为C16H12O5，分子量为284.27，密度是1.42 g/cm3，熔点在195～197℃，在760 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa）下 沸 点 为540.9 ℃。研究表明，千层纸素A具有广泛强大的生物活性，在神经保护［2，3］、抗炎［4-6］、抗瘙痒［7］、抑制宫缩［8］、保护血管内皮细胞［9］、抗肿瘤［10-11］等方面发挥重大作用，是目前研究的热点。笔者从Pubmed 中文数据库、中国知网中搜索近十年关于千层纸素A 的文献，对其在抗肿瘤方面的研究进行了小结，现综述如下。

1 千层纸素A与肺癌

郭小龙［12］在研究A549 非小细胞肺癌细胞时发现，千层纸素A 可以抑制癌细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用呈时间依赖性和剂量依赖性。为了进一步探讨千层纸素A 诱导肺癌细胞凋亡的机制，研究者后续选择了B 淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白家族进行研究。Bcl-2蛋白家族是调控细胞凋亡的最主要蛋白家族之一。研究者发现千层纸素A 可以下调抗凋亡蛋白Bcl-2 和 促凋亡蛋白Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）之间的比值来调控细胞凋亡。除此之外，端粒酶与抗细胞凋亡之间存在密切联系，进一步的研究表明，千层纸素A 也能通过抑制端粒酶逆转录酶的表达，从而降低端粒酶活性，调控肺癌细胞凋亡。Snail 是一种上皮间充质转化相关的转录因子，Snail 的过表达常常导致肿瘤复发、转移以及较差的预后。WEI等［13］研究者利用非小细胞肺癌细胞系95D 细胞和A549细胞发现千层纸素A可以通过抑制MAPK/ERK信号通路的激活，从而抑制GSK-3β 信号的激活，导致Snail 的表达抑制，减少肿瘤细胞的转移能力。同时研究者利用A549 细胞构建小鼠肿瘤模型进行体内实验，发现用千层纸素A 处理的小鼠的肿瘤质量更小、转移病灶更少，验证了其抗肿瘤转移的功能。

2 千层纸素A与胃癌

YANG 等［14］发现千层纸素A 可以抑制人胃癌细胞BGC-823 细胞的增殖能力。细胞周期依靠细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，Cdk）和细胞周期蛋白（cyclin）共同调控，cyclin B 和Cdc2 精确调控G2/M 周期转化。为了探索千层纸素A 是否在细胞周期中发挥作用，研究者们利用流式细胞术检测各周期细胞的比例，结果发现用千层纸素A 处理细胞后，处于G2/M 期的细胞比例明显增加。接着研究者们检测了调控细胞周期的蛋白，发现cyclin B1、cyclin A、Cdc2 和Cdk7 四个细胞周期蛋白表达明显下降。蛋白免疫印迹实验的结果验证了流式细胞术的发现，再次证明千层纸素A 对胃癌细胞BGC-823 细胞周期的阻滞作用。

3 千层纸素A与肝癌

LIU 等［15］在前期研究中发现千层纸素A 对人肝细胞癌细胞系HepG2 细胞的促凋亡效应。为此他们进一步研究了其促凋亡机制。研究者们发现千层纸素A 通过线粒体凋亡通道（mitochondrial apoptosis channel，MAC）途径发挥对HepG2细胞的促凋亡作用。研究者们指出，线粒体相关凋亡途径最重要的是线粒体外膜的通透性改变，包括两种机制。1）线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）机 制：MPTP 存在于线粒体内膜上，当MPTP 开放时，线粒体基质渗透性肿胀，外膜破裂，使细胞色素C及其他促凋亡蛋白溢出到细胞质中诱导凋亡。2）MAC 机制：在正常细胞中，Bax 以单体形式存在于细胞质中，当凋亡相关的刺激信号（如实体肿瘤的缺氧条件）存在时，Bax 被激活，转位至线粒体膜，并形成低聚状态的同源聚合物，允许细胞色素C 和其他促凋亡蛋白通过聚合物通道释放到细胞质中发生凋亡反应。实验证明，选择性PTP 阻滞剂环孢霉素A 并不能阻止千层纸素A 诱导的细胞凋亡过程，而在细胞中检测到Bax 的活化、转位、聚合，以及Bcl-2 过表达可抑制千层纸素A 的凋亡诱导作用，证明千层纸素A 通过MAC 途径促进人肝细胞癌细胞HepG2 的促凋亡作用。

此外，ZHU等［16］发现千层纸素A可以通过Akt/PI3K 信号通路途径下调整合蛋白（Integrinβ1）的表达，逆转HepG2细胞对紫杉醇的耐药性。缺氧是很多实体肿瘤的共同特征，在研究缺氧条件下的人肝细胞癌细胞代谢中，DAI等［17］发现千层纸素A不仅通过抑制HIF-1α相关的糖酵解通路，还能通过降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，来抑制人肝癌细胞HepG2 细胞在缺氧条件下糖酵解功能。WEI 等［18］研究发现千层纸素A 可以上调M1 型丙酮酸激酶和M2 型丙酮酸激酶的比例，从而激活肝细胞核因子HNF-4α，调控目的基因的表达，促进肝细胞癌细胞的分化。

4 千层纸素A与结肠癌

解偶联蛋白2（recombinant uncoupling protein 2，UCP2）是线粒体膜上的阴离子转运超家族的一种蛋白。前期的研究认为，UCP2在癌细胞，尤其是结肠癌［19］中高表达。QIAO 等［20］研究者发现UCP2在CaCo-2结肠癌细胞中高表达可以减少活性氧ROS 的生成，进而改变MPTP 状态。MPTP 是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是线粒体相关凋亡途径的一个重要分子。而千层纸素A正能通过线粒体相关凋亡途径抑制UCP2 表达、激活MPTP、在细胞内富集ROS，最终导致CaCo-2 细胞的凋亡。但在HepG2 肝癌细胞研究中，MPTP 并没有被激活，激活的MAC 促进肝癌细胞的凋亡。

基于对肝癌细胞代谢［16］的研究，NI 等［21］研究者继续研究了千层纸素A 对结肠癌细胞的代谢影响。在缺氧条件下，缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）可以上调脂肪分化相关蛋白、脂肪酸合成酶、固醇调节元件结合蛋白1，并且下调肉碱棕榈酰基转移酶1，从而促进脂质的摄取和转运，增加脂肪酸合成，减少脂肪酸氧化。千层纸素A 可以抑制HCT-116 结肠癌细胞HIF-1α 的表达，降低细胞内的脂肪酸水平，进而抑制Wnt 信号通路，使细胞分裂阻滞在G/M 期，抑制癌细胞的增殖。同时进行的体内实验也验证了千层纸素A延缓肿瘤进展的抗癌作用。

5 千层纸素A与乳腺癌

乳腺癌是女性最常见的癌症，约占女性新发癌症病例的30%，同时也是导致女性癌症相关死亡的第二大原因。SUN 等［22］发现千层纸素A 可以抑制MDA-MB-435 细胞的迁移、侵袭能力，并且具有浓度依赖性。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）中的MMP-2、MMP-9 是癌细胞侵袭、转移过程中的两个关键酶。MMP-2、MMP-9的激活降解细胞外基质，破坏完整的基底膜，导致癌细胞侵入血管和淋巴管，向远处转移。为了研究千层纸素A 对癌细胞侵袭迁移的抑制功能是否与MMPs 有关，研究者收集了千层纸素A 处理细胞后的上清液，检测MMP-2、MMP-9 蛋白，结果显示基质金属蛋白酶水平明显下降。MMPs 的表达与MAPK信号通路和PI3K信号通路有关，研究发现千层纸素A是通过MAPK/ERK信号通路来发挥抗肿瘤效应，而PI3K/Akt 信号通路的蛋白表达没有显著改变。在后续的实验中［23］，研究者们发现千层纸素A 下调MMP-9水平的两种机制：1）通过上调金属蛋白酶组织抑制因子TIMP-2 的水平，不仅抑制MMP-9 的表达，还减弱其合成酶的活力，从而降低蛋白水平；2）通过MAPK信号通路调节蛋白水平，千层纸素A 可以下调蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族中PKCδ的表达水平，从而减少细胞外源调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）激活，减弱ERK 对三个顺式作用元件（Sp-1、NF-κB、AP-1）的激活，其中激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）与MMP-9 表达有关。AP-1 是由原癌基因蛋白c-Fos（c-fos protooncogene protein，c-Fos）和原癌基因蛋白c-Jun（c-jun proto-oncogene protein，c-Jun）组成的异二聚体。千层纸素A不仅能降低c-Fos水平，还能抑制AP-1 结合部位的活性，从而降低AP1 的水平和功能，最终下调MMP-9的表达，形成PKCδ/ERK/AP-1/MMP-9信号通路。

另外，研究者们认为千层纸素A 能通过上调长寿基因SIRT3 的表达，使亲环素D 脱乙酰化，将己糖激酶II 从线粒体上分离，改变乳腺癌细胞的代谢［24］。后期的实验［25］证明千层纸素A 能通过SIRT-3 介导的途径上调过氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）的表达，并且下调HIF-1α 的水平，来重建乳腺癌细胞的糖代谢，从而阻碍癌细胞的增殖。千层纸素A 还能通过抑制Notch1 胞内结构域（notch1 intracellular domain，N1ICD）与Snail 转录因子的结合，来抑制乳腺癌MCF-7细胞的侵袭和迁移能力［26］。

6 千层纸素A与宫颈癌

宫颈癌是全球女性第四大高发恶性肿瘤，在中国，宫颈癌在女性中的发病率排名第六位［27］。LI 等［28］用人宫颈癌细胞系海拉（Hela）细胞构建小鼠宫颈癌模型，体内研究发现经千层纸素A 或环磷酰胺处理的小鼠的肿瘤体积、质量较对照组更小；在整个两周药物处理过程中，环磷酰胺组小鼠的体质量下降，而千层纸素A 组的小鼠前后体质量没有明显改变。接着研究者们进行了体外细胞实验，研究发现千层纸素A 能抑制Hela 细胞存活率，同时对处理后的Hela 细胞进行显微镜观察，发现细胞内出现凋亡小体，这种抑制存活的功能可能和促进癌细胞凋亡有关。为了探索千层纸素A 对Hela 细胞诱导凋亡的机制，研究者选取了Bcl-2、Bax、前半胱氨酸蛋白酶3（procaspase-3）、procaspase-8 和procaspase-9 进行蛋白免疫印迹法检测，发现经千层纸素A 处理后，线粒体相关凋亡的蛋白Bcl-2、procaspase-3、procaspase-9 的表达减少，而Bax 的表达没有明显改变；外源性凋亡途径的蛋白procaspase-8 的表达也减少。结果说明千层纸素A诱导Hela细胞凋亡可能同时启动了内源性途径和外源性途径。

7 千层纸素A与其他癌症

HUI 等［29］研 究 发 现 千 层 纸 素A 可 以 通 过PPARγ/RXRα 途径抑制急性髓系白血病细胞分化并使细胞周期阻滞在G1期。PPARγ是过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisomal proliferators activate receptors，PPAR）的其中一个亚型，是MAPK 信号通路的下游底物，MAPK 信号通路激活后可使其磷酸化而失活。千层纸素A可以抑制MAPK信号通路，下调磷酸化的ERK 水平，激活PPARγ，PPARγ 被激活后与视黄醛X 受体α 结合，抑制细胞增殖、促使细胞分化。LI 等［30］和ZHANG 等［31］发现千层纸素A 可以通过CXCL12/CXCR7 信号轴、Hedgehog 信号轴逆转髓系白血病细胞对伊马替尼的耐药性。LI等［32］发现千层纸素A可以减弱肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）治疗急性髓系白血病细胞时伴随的激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，Akt/PI3K）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的负面效应。激活的Akt/PI3K 信号通路负性调控癌细胞的分化，NF-κB 被激活后促进肿瘤细胞的增殖。千层纸素A 不仅能增强急性髓系白血病细胞对TNFα 的敏感性，增强其抑制增殖、促进分化的功能外，还能减弱其带来的上述副反应。ZOU 等［33］研究结果显示千层纸素A 可以通过mTOR 信号通路途径促进人恶性胶质瘤细胞自噬发挥抗肿瘤效应。XU 等［34］发现千层纸素A 通过抑制人恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭、转移和促进肿瘤细胞凋亡来缓解肿瘤发展过程。

8 结语

千层纸素A 抗肿瘤活性广泛，具体表现为抑制癌细胞增殖、重建癌细胞代谢、阻滞癌细胞分裂周期、诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭转移、逆转癌细胞对化疗药的耐药性等方面，其作用的信号通路包括线粒体相关凋亡信号通路、MAPK/ERK 信号通路、Akt/PI3K 信号通路、mTOR 信号通路、Wnt 信号通路、Notch 信号通路等，显示出非常显著的抗肿瘤活性。目前对于千层纸素A 的研究并没有包括药物疗效对比，它是否优于传统化疗药物或者只能用作辅助抗肿瘤药物仍未清楚；另外，据陈卫卫等［35］在文章中所述，目前千层纸素A 相关的制剂开发并不全面，尤其千层纸素A 单方制剂更少之又少，其一般作为黄芩或木蝴蝶的有效成分来发挥疗效。因而对其进行药物对比研究、制剂开发的研究，对于寻找高效低毒的抗肿瘤药物、发扬祖国传统医学具有重大意义。