DNA甲基化参与动脉粥样硬化发展的机制

谢庆雅 魏晗 辛小军 肖平喜

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是以血管内膜形成纤维斑块为特征,主要累及大动脉和中动脉,致管壁变硬、管腔狭窄和弹性减弱,引起相应器官缺血性改变的慢性退行性疾病。AS形成的危险因素包括高脂血症、高血压、吸烟、糖尿病、年龄、性别及遗传因素,可变的危险因素形成是由于基因的改变而导致基因表达产物发生改变所形成。DNA甲基化是通过沉默相关表达基因表达来调节细胞功能的重要表观遗传修饰。同时,最近的研究发现[1-3]DNA甲基化在动脉粥样硬化发展中起重要作用。为此,笔者就DNA甲基化与AS的关系进行综述以供参考,也为AS的干预及治疗提供坚实的基础。

一、DNA甲基化参与AS中内皮功能障碍

DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶的第5个碳上加入一个甲基,形成5-甲基胞嘧啶[4]。人类基因中,大部分启动子的调控都与CpG岛有关,CpG岛位于启动子附近区域,并保持非甲基化状态,从而完成基因转录。相反,这些DNA区域可被甲基化,抑制转录因子与启动子的结合,抑制基因转录。DNA甲基化在胚胎发育和生物学功能起重要作用,DNA甲基化失调,即高甲基化和低甲基化均会导致各种疾病,当然也包括AS[1]。

大量研究表明[5-6],DNA甲基化参与调节NF-κB介导的信号通路,NF-κB可上调血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)中促炎细胞因子和粘附分子的释放,如TNF-α,IL-6,IL-1,ICAM-1,VCAM-1等,促炎基因细胞色素C氧化酶亚基II的表达增强和促炎细胞因子和粘附分子表达增强密切相关,从而加速了VEC功能障碍。DNA甲基化过程需要DNMT的参与。研究表明[7],DNMT1调节炎症信号从而参与内皮功能障碍,其中DNMT1表达上调会促进krüppel样因子(krüppel-like factor,KLF)-2基因启动子甲基化,KLF-2是锌指家族转录因子中的一种转录因子,可激活VEC中的抗炎反应,抑制KLF-2基因转录会加速炎症反应,从而进一步导致EC功能障碍[8-9]。除KLF转录因子外,HOXA5也是调节炎症的重要转录因子,DNMT1是HOXA5启动子甲基化过程中重要参与者,进一步加速炎症反应,诱发EC功能障碍[10-11]。同时DNMT1还参与整合素、局灶性粘附激酶和细胞外信号调节激酶等信号通路,加速EC功能障碍,但是具体机制还有待研究[12]。DNA低甲基化与活性氧(reactive oxygen species,ROS)的指示剂8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxyguanine ,8-OHdG)密切相关。而ROS过量产生会导致氧化应激[13]。健康情况下,ROS的形成与抗氧化之间可以维持平衡,抗氧化系统起减少或清除ROS的作用[14]。慢性氧化应激可引起EC通透性增强,更促进内皮功能障碍。研究表明[15],8-OHdG对亲本链中鸟嘌呤的氧化损伤允许维持DNA甲基化模式的正常复制,而8-OHdG对新DNA链中鸟嘌呤的氧化损伤将阻止这种甲基化。也就是说,新DNA链上的DNA低甲基化与氧化应激造成的损害逃脱不了关系。值得注意的是,DNMT1和DNMT3b表达的改变与黑色素细胞系的转化有一定的关系,而黑色素细胞系的转化与氧化应激过程密切相关[16]。DNA甲基化与氧化应激的关系的研究已被不同的研究人员广泛地分析。慢性氧化应激可能通过促进AS的病理发展而改变DNA的甲基化特征。总之,DNA甲基化可能介导KLF和HOXA5等不同转录因子的表达调节AS中的炎症过程, 同时DNA甲基化负向改变可能加速AS中的氧化应激,从而加快内皮功能障碍。

VEC位于血管壁中,动脉中血液流动使血管内皮暴露于多种类型流体力学相关的负荷,包括流体剪切力,拉伸张力和静水压力[17]。动脉中曲率小的区域里稳定的层流在AS的发展中起保护作用,而动脉中曲率大区域和分叉区域里加速的涡流促进AS的发展[17-18]。大量研究表明[19-20],层流可能通过激活有丝分裂原的多种信号传导通路,例如细胞外信号调节激酶5、细胞外信号调节激酶-5和KLF-2,进而上调保护性基因和其蛋白质的表达;相反,涡流激活NF-κB和蛋白激酶ceta等多种信号传导通路,从而促进炎症发展和AS[20]。研究显示[21],在没有颈动脉结扎手术的情况下自然且长期地暴露于层流的EC中无DNMT1蛋白的表达,与对照组相比下,颈动脉结扎手术诱导涡流的动脉内皮中DNMT1表达增加。相反,给予DNMT抑制剂延缓了涡流下血管内AS病变的进展。另一项研究显示[7],EC受血液动力振荡剪切力影响后,DNMT3a表达上调,且与KLF-4启动子结合,导致KLF-4转录水平降低,KLF-4与KLF-2相似,都具有抗炎作用,故DNMT3a抑制KLF-4转录进一步导致内皮功能障碍。相反,其他催化活性的DNMT在部分动脉结扎或者暴露在涡流的EC中几乎检测不到,且蛋白水平没有明显差异[21]。VEC暴露于涡流下,DNMT1和DNMT3a的高表达激活NF-κB和蛋白激酶ceta等多种信号传导通路促进内皮功能障碍。

DNA甲基化可通过介导KLF-2和HOXA5等部分转录因子直接导致内皮功能障碍,同时涡流引发DNMT高表达而进一步加速内皮功能障碍,这均是加快AS病程的因素[7]。

二、DNA甲基化调节巨噬细胞活化

经典观点提出了巨噬细胞的M1/M2表型二分法,M1巨噬细胞参与了炎症的开始和进展,且分泌促炎细胞因子,包括IL-6和TNF-α;M2巨噬细胞与抗炎有关,并且它在组织修复,血管生成和炎症消退中起作用[22]。KLF-4转录因子在巨噬细胞活化中起关键作用,体内与体外数据表明DNMT1通过抑制KLF-4的表达从而活化M1巨噬细胞,活化的M1巨噬细胞中IL-6和TNF-α表达水平升高[23]。有趣的是,一项动物实验[24]用高脂饮食诱导母体雌鼠高脂血症,使巨噬细胞通过经典活化M1途径产生粘多糖反应,并且巨噬细胞释放IL-6和TNF-α是对照组的2倍和1.5倍。同时,诱导高脂血症的雌鼠的子代中,LXRα的5’UTR位点是低甲基化的,而LXRα是转录因子核受体超族成员,其活性抑制粘多糖诱导的M1巨噬细胞相关基因NOS2的表达[24-25]。因此,DNA甲基化调节M1巨噬细胞活化可能与LXRα和KLF-4等转录因子表达降低有关,从而加快AS进程。此外,抑制DNMT3a表达限制了巨噬细胞中Ⅰ型干扰素的产生,这可能在AS进展中具有保护作用[26]。

三、DNA甲基化调节平滑肌细胞增生

AS的病理过程包括三个重要阶段。第一阶段是通过危险因素激活EC,之后免疫细胞,如单核细胞,浸入内膜,单核细胞吞噬低密度脂蛋白促进泡沫细胞的形成。第二阶段,炎症状态下平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)通过内弹力膜的窗口迁入内膜,其增殖导致斑块形成。这些激活的SMC产生大量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)并形成纤维帽。第三阶段也是最后一个阶段是AS斑块破裂和血栓形成。由于血管SMC是AS斑块形成的主要参与者,因此血管SMC增生的调节可能在AS的发展中起重要作用[27-28]。

血管SMC在AS斑块内的多种刺激下,经历了从“收缩”表型到“合成”表型的转变[29]。在这个转变过程中,血管内膜SMC中与“收缩性”相关的蛋白,如α-平滑肌肌动蛋白的表达降低,而表现出更强的ECM和蛋白酶的合成能力。ECM主要由胶原蛋白、纤维蛋白、玻连蛋白和蛋白聚糖组成,在SMC增生中扮演着重要角色,同时也是决定斑块的完整性的重要部分[30]。ECM的DNA甲基化会影响SMC表型转换,而SMC的表型转换会引起血管钙化。研究表明[31],DNA甲基化可能控制着某些与SMC增生分化有关的基因,例如血清反应因子,PDGF和SMC特异性的SM22α。此外,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)与SMC的增生及迁移也有关[32-33]。血管SMC在DNA甲基化抑制剂作用下MMP1的表达和蛋白分泌增加[34]。同时,DNA甲基化抑制剂抑制血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)诱导的SMC的增殖和迁移,并增加血管细胞收缩力[35]。

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是在甲硫氨酸代谢过程中产生的非经典含硫氨基酸,Hcy通过甲基化在DNA代谢中发挥生理功能[36]。升高的Hcy通过抑制细胞周期蛋白A转录,降低DNMT1活性,抑制DNA甲基化,并且通过增加PDGF的表达在SMC增殖中起作用。也有研究表明[37],高Hcy血症引起凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1的DNA低甲基化,从而可能抑制泡沫细胞的形成。因此,细胞周期蛋白A的低甲基化通过升高Hcy水平可能是SMC增殖并最终导致AS的关键机制[38-40]研究表明[41],在SMC增生迁移过程中发现DNMT的活性低并且总体DNA呈低甲基化。最近的一项研究显示[42],在AS斑块中SMAD7的表达降低,SMAD7基因启动子的甲基化水平升高以及Hcy水平升高均会加快斑块形成。这些研究均证明SMC的DNA甲基化不足或者DNMT1的活性降低与SMC的迁移和增生有着密不可分的关系,进一步推动AS的形成。

四、总结与展望

目前衰老相关的系统疾病逐渐成为重要的公共卫生问题,其中AS占了很大比例,AS是一种复杂的慢性疾病,其病因涉及遗传和非遗传因素,重要的非遗传因素之一是表观遗传,表观遗传目前是血管生物学研究的新领域,最新的研究揭示其在AS形成方面有广阔的研究前景,其中DNA甲基化参与多种调控通路,从而共同作用于AS的形成。动脉粥样硬化过程中促发炎症及氧化应激,引起内皮功能障碍,巨噬细胞活化及血管SMC增生与迁移,均是AS的发展的原因。本文总结了与AS发展中可能相关的DNA甲基化机制,而这些机制与DNA突变不同,它的改变是可逆的,因此探寻干预措施显得尤为重要,目标旨在减缓不可避免的发展过程。未来的研究方向可能涉及“表观遗传药物”的潜在靶点,例如DNMT抑制剂。因此,探讨AS有关的DNA甲基化机制有助于为AS的管理治疗提供更多新的可能,具有重要临床意义。

利益冲突:所有作者声明不存在利益冲突