林蛙油冻干粉对大鼠肺纤维化药理作用及其机制的研究

李孟，吕邵娃，管庆霞，郭玉岩，杨炳友,张凤春，李永吉，匡海学*

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江四宝生物科技股份有限公司，黑龙江 铁力 152500)

2020年新型冠状病毒感染的肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)在全世界范围内肆虐，《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第八版)》[1-2]指出感染者的胸部影像学特点：早期呈多发小斑片影像伴有间质改变，肺外带处明显，可进一步发展为双肺多发磨玻璃样浸润影。研究显示[3]，基础病明确的患者影像中，多呈现为双肺弥漫性病变，少数表现为“白肺”样，并伴多发条索状阴影，由于急性期大量肺间质炎性渗出，会造成严重的肺部纤维化[4-5]，肺纤维化也是老年人常见的一种难以治愈的疾病。因此，改善肺纤维化是有效的缓解症状的方式及治疗的手段。林蛙油别名哈士膜油，是东北地区特色药材，为林蛙的干燥输卵管，收载于历年的《中国药典》之中，具有补肾填精、养阴润肺的作用，根据黑龙江省七台河市人民医院和牡丹江红旗医院等临床报告显示，对新冠肺炎的患者给予林蛙油冻干粉辅助治疗，对体质虚弱、痨嗽咳血等症效果显著，还可以改善阴虚体弱、神疲乏力、心悸失眠等。然而林蛙油冻干粉是否具有改善肺纤维化的作用未见报道，本文以林蛙油冻干粉[6]为研究对象，考察林蛙油冻干粉对大鼠肺纤维化的药理作用，为林蛙油冻干粉临床防治肺纤维化疾病的提供一定的理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD品系大鼠，体质量200～220 g。青岛市实验动物和动物实验中心提供，合格证号为SCXK(鲁)20140001。

1.2 药物与试剂

林蛙油冻干粉(黑龙江四宝生物科技股份有限公司，批号20191101)；HYP试剂盒(美国R&D Systems公司，ELA05990)；MDA试剂盒(美国R&D Systems公司，ELA05990)；SOD试剂盒(美国R&D Systems公司，ELA05990)；GSH-Px试剂盒(美国R&D Systems公司，ELA05990)；CAT试剂盒(美国R&D Systems公司，ELA05990)；TNF-α试剂盒(美国R&D Systems公司，ELA05990)；IL-6试剂盒(美国R&D Systems公司，ELA05990)；IL-7试剂盒(美国R&D Systems公司，ELA05990)。

1.3 实验仪器

101A-1E型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；FA2004分析电子天平(上海良平仪器仪表)；VICTOR X3酶标仪(PerkinElmer公司)；TDL-4型低速台式离心机(上海安享科学仪器厂)；108 mL手动组织匀浆器(天津玻璃仪器厂)；H2050R型台式高速冷冻离心机(湖南实验室仪器开发有限公司)。

1.4 分组与给药

取雄性SD大鼠63只，随机分为7组。实验室内温度保持在(22±2)℃，相对湿度55%～75%，光照时间随自然变化。大鼠均以基础饲料和蒸馏水常规饲养，自由饮食，实验大鼠适应性饲养1周后进行实验。随机分为：①正常对照组(生理盐水灌胃1 mL/d),②假手术组(生理盐水灌胃1 mL/d),③模型组(博莱霉素5 mg/kg),④林蛙油冻干粉低剂量干预组(0.05 g/kg林蛙油冻干粉混悬液),⑤林蛙油冻干粉中剂量干预组(0.10 g/kg林蛙油冻干粉混悬液),⑥林蛙油冻干粉高剂量干预组(0.20 g/kg林蛙油冻干粉混悬液),⑦泼尼松组(0.005 g/kg)。

②～⑦组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)，大鼠麻醉后，切开颈正中部位并暴露气管，③～⑦组由气管向内注入溶解了博莱霉素A5(5 mg/kg)的生理盐水0.2 mL，向②组注入等量生理盐水，然后各组大鼠均直立并旋转，使药液均匀分布在肺内。次日，①～③组2 mL生理盐水灌胃，④～⑦组灌胃给药，每日1次。

1.5 观察指标

血清TNF-α、IL-6、IL-17浓度测定，肺组织MDA、SOD、GSH-Px、CAT 含量的测定，同时观察肺纤维化大鼠肺组织病理学改变和HYP水平的变化情况。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 林蛙油冻干粉对肺纤维化大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17浓度的影响

灌胃28 d后，大鼠麻醉后开胸，以心脏采血法采集血液3 mL，离心并提取血清， ELISA法测定各组血清TNF-α、IL-6、IL-17 浓度。结果见表1。

表1 各组间血清TNF-α、IL-6、IL-17含量变化情况比较

从表1可知：模型组与正常对照组、假手术组比较， TNF-α含量、IL-6含量、IL-17含量升高并有显著性差异，证明其造模成功。

林蛙油冻干粉各给药组与模型组比较，TNF-α含量降低且有统计学意义(P<0.05)，表明林蛙油冻干粉可以明显减少炎症的发生，抑制致炎因子TNF-α的表达。IL-6含量降低均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，表明林蛙油冻干粉可以明显抑制致炎因子IL-6的表达。IL-17含量降低具有统计学意义(P<0.05)，表明林蛙油冻干粉高剂量组可明显降低炎症细胞因子IL-17的产生。

2.2 肺组织MDA、SOD、GSH-Px、CAT 含量的测定

颈动脉放血将大鼠处死，取右侧肺部组织后迅速置于-80 ℃液氮中冻存，检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)含量。检测时，取适量右肺组织匀浆，离心，提取上清液，测定MDA、SOD、GSH-Px、CAT的含量。结果见表2。

表2 各组肺组织MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量变化情况比较比较

结果表明：模型组与正常对照组、假手术组比较，MDA含量升高并具有显著性差异。林蛙油冻干粉各给药组与模型组比较，含量降低且均有统计学意义(P<0.05)，表明林蛙油冻干粉组对肺系统损伤程度有明显降低作用。林蛙油冻干粉低剂量组与模型组比较，SOD含量升高且具有统计学意义(P<0.05)，表明林蛙油冻干粉低剂量组可明显消除生物体在新陈代谢中产生的有害物质。林蛙油冻干粉中剂量和高剂量组与模型组比较，GSH-Px含量升高并具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，表明林蛙油冻干粉中剂量和高剂量可以保护细胞膜结构和功能；CAT含量升高并具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，表明林蛙油冻干粉清除自由基能力强，具有保护细胞免受自由基的损伤的作用。

2.3 林蛙油冻干粉对肺纤维化大鼠肺组织病理学改变和HYP含量的影响

将10 %中性福尔马林液经主支气管注入左肺，并使胸膜展开。而后将其放入10 %中性福尔马林液中固定24 h以上，用石蜡包埋，切片，HE染色及Masson染色[7]。用HE染色评定肺组织肺泡的炎症程度：0分为无肺部组织炎；1分为轻度的肺部组织炎，炎性细胞浸润仅为局部或近胸膜部，其面积小于全肺的20%；2分为中度肺部组织炎，其炎性受累面积约占全肺地20%～50%；3分为重度肺部组织炎，其受累的面积大于50%。Masson染色评定肺组织纤维化程度：0分：无肺纤维化；1分：轻度肺纤维化，受累面积少于全肺20%；2分：中度肺纤维化，受累面积占20%～50%；3分：重度肺纤维化，受累面积大于50%，肺泡结构紊乱。结果见图1和图2。取适量右肺组织匀浆，离心，提取上清液，采用试剂盒测定HYP含量，见表3。

表3 肺部炎症和纤维化的比较分数和HYP含量

图1和图2结果表明：正常对照组、假手术组的大鼠肺部组织结构清晰，无病理改变；模型组的肺泡间隔明显地增厚，多数大鼠肺泡壁的结构紊乱，较多炎症细胞浸润，肺部纤维化明显；林蛙油冻干粉组上述病变明显减轻。

注：A:正常对照组B:假手术组C:模型组D:林蛙油冻干粉低剂量组E:林蛙油冻干粉中剂量组F:林蛙油冻干粉高剂量组G:泼尼松组。图1 HE肺组织染色图(×20)

注：A：正常对照组 B：假手术组 C：模型组 D：林蛙油冻干粉低剂量组 E：林蛙油冻干粉中剂量组 F：林蛙油冻干粉高剂量组G：泼尼松组。图2 Masson肺组织染色图(×20)

由表3可知，林蛙油冻干粉低剂量和中剂量组与模型组比较，肺泡炎、肺纤维化评分及肺组织HYP含量均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明林蛙油冻干粉低剂量和中剂量组可减轻肺纤维化及肺泡炎程度。

3 讨论

肺纤维化是由多种肺内外致病因素所导致的慢性、间质性肺疾病，是一种致命的肺部疾病，病理表现为肺泡上皮细胞的损伤和异常增殖，大量细胞外基质的沉积和成纤维细胞的增殖和活化[8-10]，导致肺部结构破坏和呼吸功能的丧失。肺纤维化的死亡率较高，据近5年数据显示，患者的平均生存周期仅为2.8 年，死亡率较大多数肿瘤疾病高，有“类肿瘤疾病”[11]之称。肺纤维化的形成和发展过程复杂，机制不明，但既往的研究提示氧化应激和过度炎症反应在其疾病的发展中具有重要作用[12]。近年来，肺纤维化发病率呈上升趋势，因此寻找安全有效药物治疗已成为迫切需要。

TNF-α可诱导T细胞产生多种炎症因子[13]，激发炎症的产生。IL-6、IL-17是由多种细胞产生并作用于的一类细胞因子，能在急性炎症反应中诱导急性期地反应蛋白合成。这几类均为导致肺损伤地重要的致炎因子，抑制其产生能够在一定程度上缓解肺纤维化炎症细胞浸润、活化，改善细胞因子异常分泌，以及肺部纤维化的病理过程。林蛙油冻干粉可有效抑制TNF-α的产生，明显减缓肺纤维化炎症细胞活性。

丙二醛是脂质过氧化反应时产生的代谢产物，当机体发生氧化应激时，自由基产生过多，超过了机体的清除能力，使氧化/抗氧化处于失衡状态。MDA的含量可反映机体内脂质过氧化的程度。林蛙油冻干粉可有效降低机体MDA的含量，对系统损伤程度有明显降低作用。

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶都是内源性抗氧化酶，可反映机体清除氧化自由基的能力。GSH-Px作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，当与一定物质结合后，可把机体内有害物质转为无害物质，并将其排出体外。CAT的主要作用就是将H2O2催化分解变成H2O与O2，使H2O2不至于与O2反应产生有害的·OH，能够对机体产生保护作用。林蛙油冻干粉可使细胞SOD含量、GSH-Px含量、CAT含量升高，可明显消除生物体在新陈代谢中产生的有害物质，可保护细胞膜结构和功能，清除自由基的能力变强，具有保护细胞免受自由基损伤的作用。

羟脯胺酸是脯氨酸羟化酶催化前α-肽链中脯氨酸残基而形成，主要存在于胶原中，当体内结缔组织大量增生或破坏时均可造成血、尿中羟脯氨酸含量的增加，因此羟脯氨酸含量降低可代表炎症症状减轻。林蛙油冻干粉可使HYP含量明显降低，具有减轻肺纤维化及肺泡炎的积极意义。

现代药理学研究表明林蛙油具有抗衰老、抗疲劳等药理作用[14-16]。还可提高机体免疫功能和应激性能，含有极其丰富的 Vit E[17]。林蛙油本身就具有多种使用方法，除炖服外,口服需泡发后使用，泡发周期长，而林蛙油冻干粉更是质地疏松，泡发后迅速膨胀为原始体积的100倍以上，经多方实验参数所制得的林蛙油冻干粉具有含水量低、复水性好、质量稳定、使用方便等特点。林蛙油冻干粉为林蛙油的广泛应用提供了更为便捷、更为有效的途径。

本研究结果表明，林蛙油冻干粉可在一定程度抑制肺纤维化的发生发展，其机制与减轻炎症反应同时增强机体抗氧化能力有关，该结果的揭示为临床的用药提供了药理学的依据。虽然目前尚缺乏针对新冠肺炎后肺间质纤维化倾向地大样本的临床研究，但本文为探讨林蛙油治疗新冠肺炎后肺间质纤维化倾向疾病提供了理论支持。