小鼠外翻肠囊法初探左金丸中季胺型生物碱的肠吸收特性

吴迪,高原,杨娜娜,韩晓宇,刘树森,孙文斌,王旭,徐蓓蕾*

(1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.北京鑫开元医药科技有限公司，北京 101102)

左金丸出自《丹溪心法·火六》，主治肝经火旺之证，后世医家多用于肝火犯胃、胃气上逆之胁肋胀痛、呕吐吞酸、嗳气口干、舌红苔黄、脉象弦数等症[1]。伍曙霞[2]研究表明,左金丸结合养胃汤可以用来治疗慢性萎缩性胃炎，并具有明显的治愈效果。常用于治疗肝火犯胃，肝胃不和证。现代临床多用于胃炎、食道炎、胃溃疡等属肝火犯胃者。本次实验主要针对左金丸中的季胺型生物碱进行研究，考察其在小鼠肠囊中的吸收特性。

1 材料

1.1 动物

ICR小鼠，雄性，体质量(20±2)g，购自长春亿斯实验动物技术有限公司，合格证编号：20180613。

1.2 药物与试剂

黄连、吴茱萸药材购自哈尔滨三棵树药材市场；小檗碱、药根碱、巴马汀对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为：120620、120423、110311；乙腈、甲醇为Merck公司，色谱纯。

1.3 仪器

高效液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific)；紫外检测器(UltiMate®3000 ECD3000RS)；电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司，DK-98-11A)。

2 方法

2.1 K-R试液(肠液)的配置

精确称取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，溶解定容至1 000 mL容量瓶中，用稀盐酸调节pH至7.0～7.2[3]。

2.2 对照品溶液制备

取小檗碱、药根碱对照品适量，加入适量的甲醇，制成浓度为0.00 5 mg/mL、0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL的对照品备用；取巴马汀对照品适量，加入适量的甲醇，制成浓度为0.00 1mg/mL、0.00 5 mg/mL、0.01 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL的对照品备用。

2.3 左金丸药液制备

按黄连和吴茱萸的比例为6:1称取生药，先用10倍蒸馏水浸泡0.5 h，熬制1 h后，将滤液滤出，后加入8倍量的蒸馏水继续熬制0.5 h，后将药液滤出，与之前滤出的药液混合，蒸发浓缩后熬制成浸膏[4]。将浸膏溶于Krebs-Ringer’s试液中，得到浓度分别为 422.74、211.37、105.685 mg/mL的左金丸药液，作为本实验的高、中、低剂量组。

2.4 HPLC色谱条件

高效液相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，按每100 mL/0.4 g十二烷基硫酸钠，溶于比例为50∶50的乙腈和水的混合溶液中，用磷酸调节pH值至4.0，形成以乙腈-水(含0.05 mol/L磷酸二氢钾)溶液的流动相。选择吸收度最大的345 nm波长作为测定波长。

2.5 外翻肠囊法测定小肠吸收面积

ICR小鼠实验前禁食不禁水12 h，称重，以水合氯醛麻醉，沿小鼠的腹中线和腹白线剖开，迅速将整个肠段离体，清理肠表面组织和血管。将肠道分段成5～7 cm左右4个肠段，用37 ℃的Krebs-Ringer’s试液进行冲洗，至肠内无内容物为止。将肠段翻转，用冰冷Krebs-Ringer’s试液冲洗肠段表面，将肠段固定，另一端用丝线扎紧，形成肠囊。在肠囊中注入1 mL左右的37 ℃ Krebs-Ringer’s试液，将肠囊放至37 ℃ Krebs-Ringer’s试液EP管中，平衡五分钟[5]。后放入含不同浓度的左金丸Krebs-Ringer’s溶液的EP管中，通入95%的O2与5%的CO2混合气体，调节气流0.02 MPa。实验需在37 ℃恒温水浴锅中进行，分别在0 min、20 min、40 min、60 min、90 min取样200 μL后，补充等体积的空白37 ℃的Krebs-Ringer’s试液。抽取肠囊内的样品后过0.22 μm有机滤膜，在-20 ℃温度下保存。实验结束后，记录每段肠囊的吸收面积A。

2.6 数据分析

累计药物吸收量公式[6]：

其中Q为各时间的累积药物吸收量，Cn为各时间点取样的实际检测浓度(μg/mL)，V0为平衡前肠管中加入的台氏液体积(mL)，V为每次取样的体积(mL)，L为药物的累积吸收量对时间作相关回归分析得出的斜率，A为肠段吸收表面积(cm2)

表观渗透系数用公式：

Papp=ΔQ/Δt×A×C0

吸收速率常数[Ka,μg/(min·cm)]的计算公式：

Ka=L/A

3 结果

3.1 标准曲线的绘制

取“2.2”项下方法配置的对照品溶液，按照“2.4”项下色谱条件进行测定。记录色谱图，以峰面积为横坐标，以浓度为纵坐标，进行线性回归，标准曲线回归方程分别为：小檗碱：y=0.000 8x+0.000 4，R2=0.998 9；药根碱：y=0.000 6x+0.000 1，R2=0.999；巴马汀：y=0.000 9x-0.001 4，R2=0.994 5。小檗碱、巴马汀、药根碱标准品的色谱图见图1。

图1 小檗碱、巴马汀、药根碱标准品色谱图

3.2 精密度考察

将小檗碱、药根碱、巴马汀标准品溶液，连续进样5次，测定日内精密度，再分别将对照品第1、3、5天内各测定1次，测定日间精密度。日内精密度分别为：

1.48%、1.65%、1.37%，日间精密度分别为：1.23%、1.39%、0.42%。

3.3 稳定性考察

精密吸取各剂量中的同一小鼠的同一段肠囊中的供试品溶液20 μL，分别于0～24 h内测定小檗碱、药根碱、巴马汀标准品峰面积，得RSD值分别为：1.82%、0.81%、0.44%。说明小檗碱、药根碱、巴马汀标准品稳定，符合实验要求。

3.4 肠内样品含量测定结果

取供试品溶液20微升进高效液相，按照“2.4”项下条件进行测定，样品的色谱图见图2。

图2 样品色谱图

将得到的峰面积值带入标准曲线中，计算出其中的各组分的浓度，用2.6项下公式计算出浓度、平均吸收药量ΔQ和Papp值的±s，以时间为横坐标,以累计吸收量为纵坐标,得到吸收速率常数K，结果见表1。从表1可以看出，随着时间的增加，小檗碱、巴马汀、药根碱的平均吸收量均Q值逐渐增加，随着浓度的增加,高、中、低3个剂量组的吸收量增加幅度明显，接近成倍增加，符合浓度增加1倍吸收增加量增加近1倍的吸收特性。3种生物碱的Papp值随浓度的增加呈逐渐增大的趋势。在同一肠段中，3种生物碱的Papp值随时间的增加在20～40 min时有所降低，在40 min后趋于稳定。

表1 3种生物碱不同时间、不同浓度在肠囊内的ΔQ值与Papp值及吸收速率常数K值

以时间(min)为横坐标、以累计吸收量Q(μg)为纵坐标得到浓度对吸收量的曲线所得K值，见图3。图3-1为小檗碱3个浓度对吸收量的曲线所得K值，分别为0.97、0.98、0.98。图3-2为巴马汀3个浓度对吸收量的曲线所得K值，分别为 0.98、0.95、0.98。图3-3为药根碱3个浓度对吸收量的曲线所得K值，分别为0.99、0.96、0.94。由所得K值均大于0.9可以看出三种生物碱的肠吸收均为零级吸收，随时间与浓度的增加吸收量值逐渐增大，具有一定的线性关系，符合被动转运吸收方式[7]。

图3 3种生物碱不同浓度对吸收量的曲线所得K值

4 讨论

外翻肠囊模型是一种极为简单而又快速检查药物吸收以及确认肠道代谢的方法，广泛应用于小肠吸收的研究。本实验采用外翻肠囊法结合高效液相色谱法，检测左金丸浸膏中的小檗碱、药根碱、巴马汀含量，实验得到的吸收结果与体内药物吸收的真实水平接近。并且其吸收成分的种类少于汤中的成分，因此与药物的谱效相关分析相比较，外翻肠囊法所注重的是药物与机体的相互影响，并且此方法的结果分析难度较低。左金丸的主要化学成分在外翻肠囊中主要的吸收过程为累积吸收，在此过程中极少受其他因素如分布、代谢及排泄等过程的影响，并且可以避免对检测条件要求高的弊端，因此利用外翻肠囊法进行研究可以为谱效相关的研究提供依据。

本次实验采用ICR小鼠，对左金丸中三种生物碱成分进行了肠吸收研究，通过外翻肠囊法研究发现,左金丸中3种生物碱成分在小鼠肠囊内的吸收K值均大于0.9,说明3种成分均为零级吸收。研究发现小檗碱、巴马汀、药根碱三种生物碱在同一时间段内平均吸收量ΔQ随浓度的增大而增加，同时Papp值也随浓度的增加而呈增加趋势。在同一浓度下，随着孵育时间的延长单位面积的平均吸收量ΔQ增加，表观分布系数Papp值会随时间的延长而减小最后趋于稳定。Papp值的减少可能是肠上留有的活性蛋白，其对于药物的扩散具有促进或抑制作用。此外还可能与肠囊内外溶液浓度差逐渐缩小，肠囊内浓度逐渐饱和有关。不同剂量，面积大小几乎相等的肠段高剂量实验组的累积吸收药量明显高于中、低剂量实验组，符合前期的设想：左金丸中小檗碱在肠内的吸收过程主要与肠囊的面积、药液浓度以及吸收时间有关。

已知某些药物在小肠中具有优先吸收位点，了解此类口服药物的主要吸收部位对于开发理想的药物产品以及实现临床有效和可靠的药物治疗非常重要[8-12]。因此，研究药物在体内的吸收过程具有重要的意义，同时，此项研究还可以为药物体内分布，代谢等研究提供一定的依据。