耐药性肺结核患者血清IL-22、TNF-α水平与耐多药免疫机制的相关性*

王永峰，侯永华，王 翔，李 琛

（河北省胸科医院 1.肺结节三科；2.内分泌科，石家庄 050041）

肺结核（tuberculosis，TB）是世界上感染致病菌后致死率居于首位的传染病，确诊后为防止病情进一步恶化，可以采用抗结核杆菌的治疗方法[1]。我国传染科病房资料显示，结核杆菌对已治愈过的TB药物耐药性日益增强，耐药性肺结核（drug-resistant pulmonary tuberculosis，DR-TB）发生率逐年增高[2]。DR-TB 病情发展急骤、变化迅速且较凶险，常累及多器官系统，尚无特效疗法而直接导致死亡。探索更迅速、有效的治疗DR-TB 患者的方法已成为医学研究热点，有学者认为DR-TB 治疗效果较差原因是未对特异性指标进行细致观察和及时处理[3]。DRTB的临床表现是病情的进一步加重，导致患者免疫功能的削弱，从而导致患者病情的延误。基于DRTB发病机制，大量学者指出增加机体免疫系统可有效治疗DR-TB[4]。临床上目前对较敏感的评估性指标尚不清楚，有研究发现，DR-TB 发生与发展与多种免疫细胞相关，其中报道较多的有Th相关细胞及其因子[5]。另有文献显示，血清白介素-22（interleu‐kin-22，IL-22）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis fac‐tor-α，TNF-α）水平增加与DR-TB的发生和发展有一定关系[6]。本研究探讨IL-22、TNF-α 在DR-TB 患者中的表达，现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017 年7 月至2019 年7 月河北省胸科医院结核内科收治的DR-TB 患者68 例和敏感TB 36例为研究对象，病例纳入标准：（1）DR-TB 诊断符合WHO 于2014年推出的《耐药结核病规划管理指南》的诊断标准[7]；（2）年龄18～65 岁；（3）近期未使用激素类药物或免疫调节剂；（4）对本研究治疗方法有耐受性；（5）心、肝、肾功能正常；（6）患者住院资料完整，各项辅助检查均已完成。排除标准：（1）对本研究使用的药物过敏者；（2）合并其他肺部疾病者；（3）妊娠或哺乳期妇女；（4）严重精神疾病或心血管、造血系统，肝、肾等严重原发性疾病者；（5）合并肺性脑病、休克，头晕者；（6）广泛耐多药结核病者。本研究已取得医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

将DR-TB 患者按治疗方法不同分为治疗1 组（34 例，单纯抗结核治疗）和治疗2 组（34 例，免疫治疗＋单纯抗结核治疗）。敏感TB 患者为对照组，采用单纯抗结核治疗。治疗1组中，男20例，女14例；平均年龄(58.09±5.87)岁；平均病程(10.02±5.45)年；急性发作平均时间(7.76±4.23)d。治疗2 组中，男21 例，女13 例；平均年龄(57.93±6.02)岁；平均病程(10.37±5.22)年；急性发作平均时间(8.02±4.19)d。对照组中，男19 例，女17 例；平均年龄(58.21±6.23)岁；平均病程(11.02±5.57)年；急性发作平均时间(8.13±4.62)d。3组性别、年龄、病程等一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

3 组治疗方案均在WHO 标准化方案基础上联合个体化治疗。给药方案：采用莫西沙星、左氧氟沙星、吡嗪酰胺、利福喷丁、阿米卡星、丙硫异烟胺联合用药，所用药物的用法及用量如下：莫西沙星0.4 g/次，1 次/d；左氧氟沙星0.4 g/次，1 次/d；吡嗪酰胺0.75 g，2 次/d；阿米卡星0.5 g，1 次/d；利福喷丁0.45 g/次，2 次/周；丙硫异烟胺0.15 g/次，3 次/d，所有药物均为口服。DR-TB 标准化疗程为痰阴转换后6个月或至少4个月，共12个月，在治疗结束后行免疫调节疫苗分枝杆菌注射液22.5 μg肌注1周。

1.3 观察指标

1.3.1 影像学图采集 A 级（显著）：病变吸收面积大于基底病变面积的1/2；B 级（吸收）：1/5～1/2；C级：小于1/5；D级：病变面积增大。

1.3.2 IL-22 和TNF-α 水平检测 空腹取静脉血4 mL，采用LFF-LC-1781 全自动生化分析仪（美国贝克曼生物有限公司）法检测血清IL-22 和TNF-α水平。

1.3.3 Th细胞亚群CD3+、CD8+、CD4+/CD8+检测 使用EPICS-ALTRA 流式细胞仪（苏州生物基因技术有限公司）检测Th细胞亚群CD3+、CD8+百分比及CD4+/CD8+比值。所用试剂购自迈瑞生物科技有限公司。

1.3.4 临床疗效及不良反应 比较3组临床有效率和不良反应发生率。（1）DR-TB 有效：治疗结束后连续3 次及以上痰培养阴性，咳嗽，咳痰，咯血，胸痛，呼吸困难，盗汗，乏力，食欲降低等临床症状消失，肺部影像学检查正常；（2）单纯性TB 有效：治疗结束前1 个月及结束后痰抗酸染色阴性，咳嗽，咳痰，咯血，胸痛，呼吸困难，盗汗，乏力，食欲降低等临床症状消失。记录治疗过程中一过性头晕、过敏性休克、低血压发生例数。

1.3.5 结核菌转阴率（1）痰抗酸染色：患者留取3份痰标本（清晨痰、夜间痰及随机痰），收集至无菌彭氏杯标本盒内送检痰涂片抗酸染色。（2）痰结核菌培养：患者留取痰标本收集至无菌痰标本盒内，处理后，将MGIT 培养管置入BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪孵育培养，其荧光强度记忆探测仪每隔60 min连续测定培养管内荧光强度。

1.3.6 IL-22、TNF-α对T细胞体外刺激诱导实验 将DR-TB 患者外周血CD4+、CD8+T 细胞纯化，使用10%胎牛血清中培养，每孔加2×105个反应细胞且按1∶1、2∶1、4∶1 的细胞比例加入刺激细胞，设置为实验组，将1 个平行孔中加入等体积PBS 溶液设为空白组；取实验组和空白组上清液，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测IL-22、TNF-α 水平。试剂盒购自迈瑞生物科技有限公司。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson 相关检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组治疗前、后影像图

治疗前，3 组均有结核感染病灶；治疗6 个、12个月后，3 组病灶均有吸收，对照组、治疗1 组、治疗2 组吸收分别达到A 级、D 级和C 级，对照组和治疗2 组的吸收率明显高于治疗1 组，但治疗2 组与对照组无明显差别，见图1。

2.2 3组治疗前、后IL-22、TNF-α比较

治疗前，治疗1 组、治疗2 组IL-22、TNF-α 水平均高于对照组（P＜0.05）；治疗6 个、12 个月后，3 组IL-22、TNF-α 水平均低于治疗前（P＜0.05），对照组和治疗2 组IL-22、TNF-α 水平低于治疗1 组（P＜0.05），见表1。

2.3 3组免疫功能指标比较

治疗前，治疗1组、治疗2组CD3+T细胞百分比显著高于对照组，CD4+/CD8+比值低于对照组（均P＜0.05）；治疗6个、12个月后，治疗2组、对照组各免疫功能指标与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且对照组、治疗2 组与治疗1 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 IL-22、TNF-α与免疫功能指标的相关性分析

图1 3组治疗前、后影像图

表1 3组治疗前、后IL-22和TNF-α水平比较 ng/L，±s

表1 3组治疗前、后IL-22和TNF-α水平比较 ng/L，±s

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组同一时间点比较，&P＜0.05；与治疗1组同一时间点比较，#P＜0.05。

表2 3组免疫功能指标比较 ±s

表2 3组免疫功能指标比较 ±s

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组同一时间点比较，&P＜0.05；与治疗1 组同一时间点比较，#P＜0.05。

Pearson相关性分析显示，IL-22、TNF-α 与CD3+、CD8+、CD4+/CD8+均呈正相关关系（P＜0.05），见图2。

2.5 3组临床疗效、结核菌转阴率、不良反应发生率比较

治疗12 个月后，对照组和治疗2 组临床有效率和结核菌转阴率均高于治疗1 组（P＜0.05），治疗2组与对照组临床有效率、结核菌转阴率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3 组不良反应发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.6 IL-22、TNF-α对T细胞体外刺激诱导实验

加入IL-22、TNF-α 刺激的实验组CD3+、CD8+下降趋势较空白组有明显差异（P＜0.05），见图3。

图2 IL-22、TNF-α与免疫功能指标的相关性分析

表3 3组临床疗效、结核菌转阴率、不良反应率比较 n（%）

图3 IL-22、TNF-α对T细胞体外刺激诱导实验图

3 讨论

临床资料已证实，DR-TB 治疗矛盾多，疗效不佳[8]。有文献显示，TB 产生的高耐药性与细胞免疫应答障碍密切相关[9]。陈伟伟等[10]指出，一般抗结核治疗作为目前DR-TB 常规治疗方式不能调控巨噬细胞等免疫细胞基质，肺部情况无明显改善甚至加重。TB治疗后产生高耐药性发展为DR-TB，而DRTB病情变化更迅速、骤急，免疫机制进一步受损，治疗难度增加。沈娟等[11]通过实验发现，免疫疗法可改善CD3+、CD8+，促进病灶吸收。多种因素都会影响其作用机制，郑伯俊等[12]将大鼠作为研究对象，实验结果显示IL-18 作用后的Th22 细胞分泌功能提高，表明机体免疫功能受一些免疫因子影响。综上考虑对免疫因子在DR-TB 患者中的表达水平及作用，可能对该病更优治疗方案作出相关建议。

TB 治疗早期，肺部未发生组织学及生物学改变，药物治疗能改善炎症表现。严重的免疫功能障碍会使机体抵抗结核杆菌能力减弱，并产生耐药性。研究调查显示DR-TB 发生与T 淋巴细胞亚群有关，CD3+、CD4+/CD8+比值失衡标志着机体免疫功能紊乱[13]。CD3+是成熟T 细胞的表面标志物，盐桥可以连接T 细胞抗原受体（T cell antigen receptor,TCR），参与T细胞信号转导。CD4+是一种辅助性T淋巴细胞，其功能是协助免疫球蛋白G（immuno‐globulin,IgG）、IgA 和IgM 的合成。冯丽[14]指出，CD4+可进行抗结核免疫调节，其机制是同时改变T细胞增殖和细胞因子。CD8+主要是细胞毒性T 淋巴细胞，可引CD4+/CD8+失衡，干扰B 淋巴细胞功能，减少体内抗体数量。Th22细胞可通过分泌多种细胞免疫因子发挥免疫抑制作用，Abebe 等[15]的小样本实验中指出，通过IL-22、TNF-α 发挥作用的Th22细胞，对免疫具有较强的抑制作用。有研究结果表明通过TNF-α 过量表达有助于抗结核杆菌感染的敏感性增加，这对DR-TB 免疫应答有很好的研究价值。在众多肺部免疫细胞中IL-22 减少后肺部很难自我修复，这会加重其感染的风险[16]。有研究发现，进行基因敲除观察IL-22 含量变化，能够明显发现Th22细胞产生的免疫机制通路中IL-22的含量发生变化[17]。另外，文玉欣等[18]研究显示，IL-22 呈高表达水平，机体无法导致其变化敏感性。本研究结果显示，DR-TB 患者体内血清IL-22、TNF-α 含量增多（P＜0.05），提示IL-22、TNF-α 与该病发生有一定相关性。对DR-TB 患者采取不同治疗方法发现免疫调节组免疫功能显著改善，考虑与结核杆菌吸收更显著有关。IL-22可激活巨噬细胞，进而对胞内炎性物质进行清除已得到证实，而其与TNF-α 共同作用进一步加强免疫机制[19-20]。为了验证IL-22、TNF-α 与DR-TB 免疫机制相关性，本研究采用T 细胞体外实验，在IL-22、TNF-α 能够使CD3+、CD8+下降趋势显著增加，说明IL-22、TNF-α 可提高DR-TB免疫机制。

综上，IL-22、TNF-α与DR-TB发生、发展密切相关，且对免疫机制起重要作用，该病治疗过程中应多关注IL-22、TNF-α 浓度。但由于时间限制、样本量小，未深入探究产生IL-22 的不同细胞对结果的影响，另外，不同的免疫因子可能存在不同的作用机制，仍需进一步分析。