5-HT2A受体对七氟醚或丙泊酚麻醉联合Aβ1-40诱导的大鼠术后认知障碍的影响*

希尔娜衣·艾孜买提，杨 龙，马海平

（新疆医科大第一附属医院麻醉科，乌鲁木齐 830054）

心脏手术患者术后较易出现中枢神经系统并发症[1-2]，最常见的就是术后认知功能障碍（postoper‐ative cognitive dysfunction,POCD）。POCD 表现为术后记忆力减退、注意力不集中和定向能力低等，其发病机制目前尚未阐明[3]。七氟醚（sevoflurane,Sevo）和丙泊酚（propofol,PRO）是临床上应用较为广泛的全麻药物，其中Sevo在临床上是用于诱导麻醉的吸入型麻醉药[4]，PRO 是静脉麻醉药物。研究表明，七氟烷和PRO 均会对大鼠认知造成一定的损伤[5-6]。目前认为，诱发POCD 的主要原因为麻醉药的使用，包括Sevo用于麻醉的诱导和维持危重患者的镇静等[4]。PRO可改变海马Tau蛋白磷酸化水平，而导致POCD 的发生[5-6]。五羟色胺（5-hydroxytryp‐tamine,serotonin,5-HT）是一种有效的神经保护剂，研究表明，5-HT 受体在认知的调控中发挥重要作用[7]。但5-HT2A 受体激动剂对改善认知功能障碍的作用仍不清楚。本研究旨在探讨5-HT2A 受体激动剂[1-(2,5-dimethyl-4-iodophenyl) -2-aminopro‐pane,DOI]对Sevo 和PRO联合Aβ1-40诱导的大鼠POCD的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与主要试剂 Sevo（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20040772）；PRO（四川蜀乐药业股份有限公司，批号0405027）；DOI（美国sigma 公司）。戊巴比妥钠（美国sigma 公司）。原位细胞死亡检测试剂盒（德国罗氏诊断有限公司）；山羊血清（北京阳光生物科技）；兔抗鼠5-HT2A 受体一抗和山羊抗兔IgG H&L（美国Abcam公司）。

1.2 实验动物 4 个月龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，SPF 级，体重416～477 g，购自新疆医科大学动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK（新）2019-0003，使用许可证号：SYXK（新）2019-0015。本研究动物实验均通过新疆医科大学动物伦理委员会批准。动物饲养于（24±2）℃和40%～70%相对湿度的通风笼中，每24 h 一个明暗循环（06:00～18:00明、18:00～06:00暗），自由摄食和饮水。

1.3 动物分组与处理 将50 只大鼠随机分为5 组（n=10），即假手术组、Sevo-POCD 组、PRO-POCD组、DOI+Sevo-POCD 组、DOI+PRO-POCD 组。将5组大鼠分别置于相应的恒温玻璃容器内，并使其保持自主呼吸。（1）假手术组：由进气孔通入正常空气（流速为2 L/min），腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg），在海马区注射2 μL 生理盐水；（2）Sevo-POCD组：通入流速为1 L/min 的氧气+1 L/min 空气+3.4%Sevo 进行麻醉（德尔格Fabius Plus 型麻醉机），随后海马区注射2 μL Aβ1-40（5 μg/μL）诱导POCD；（3）PRO-POCD组：由进气孔通入正常空气（流速为2 L/min），按100 mg/kg 剂量腹腔注射3 mL PRO 进行麻醉，随后海马区注射2 μL Aβ1-40；（4）DOI+Sevo-POCD 组：在Sevo-POCD 组处理基础上立即一次性静脉注射0.5 mg/kg 的DOI；（5）DOI+PRO-POCD组：在PRO-POCD 组处理基础上立即一次性静脉注射0.5 mg/kg的DOI[8-9]。1次/d，连续5 d。

1.4 Morris 水迷宫实验评估大鼠认知功能 每组处理完24 h 后，连续进行7 d 的水迷宫测试，其中包括隐藏平台测试和空间探索测试。（1）隐藏平台测试：水迷宫以池底圆心为中心等分为4个象限，分别表示为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限。平台放置于目标现象（第Ⅱ象限）。将大鼠从面对泳池壁从每个象限中放入水中，游泳90 s 以找到隐藏平台。逃避潜伏期为在池中定位隐藏平台所需的时间。若在90 s后未找到平台，则将大鼠定向到平台，并将分数计为90 s。前4 d用于训练。排除得分为90 s的大鼠，将第5天的测试得分记录为动物的空间学习和记忆的得分。（2）空间探索实验：在隐藏平台测试结束24 h 后将平台移开。将大鼠置于与以前相同的水中，记录其游泳路径60 s。记录大鼠在第Ⅱ象限停留时间和穿越平台的次数。记录大鼠的轨迹，并使用莫里斯水迷宫视频分析系统（WMT-100S，Taimeng）进行信息处理。

1.5 神经功能评分[10]在建模后的第3 天，使用Garcia评分法评估实验动物的神经功能。（1）动物的活动范围：无移动（0分），乎不能移动（1分），活动范围少于笼子3 个面（2 分），活动范围大于等于笼子3 个面（3 分）；（2）四肢动作对称性：单侧不活动（0 分），单侧可轻微活动（1 分），单侧肢体活动对侧有轻微动作（2分），两侧动作对称（3分）；（3）前肢运动对称性：单侧不能运动（0分），单侧仅轻伸（1分），可运动单侧稍弱（2分），前肢对称伸展（3分）；（4）金属笼中攀爬能力：无动静（0分），几乎无攀爬（1分），有攀爬，单侧稍弱（2 分），正常攀爬（3 分）；（5）触摸身体两侧和触须反应：无（0分），单侧无反应（1分），单侧反应弱（2分），有对称的反应（3分）。动物机能正常时最高评分为18 分，其中笼里自由活动5 min、四肢动作对称性、前肢运动对称性、金属笼中攀爬能力、触摸身体两侧的反应、触须反应这6 项各得3分。

1.6 苏木精－伊红（HE）染色法观察大鼠海马组织病理学变化 所有测试完大鼠1 周后以断颈法处死，分离完整脑组织，并剥离海马组织，使用福尔马林固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，4 μm 连续切片，二甲苯脱蜡；苏木精染色5 min，PBS洗涤，伊红染色30 s，梯度酒精脱水，中性胶封片，光学显微镜下观察海马组织病理变化。

1.7 TUNEL 测定神经元细胞凋亡率 使用原位细胞死亡检测试剂盒，将石蜡包埋的海马组织5 μm切片用二甲基苯脱蜡两次，每次10 min，通过梯度渗透洗脱酒精；置于37 ℃湿润暗箱中用50 μL TUNEL反应溶液处理60 min。显微镜下随机选取10 个视野，观察并记录棕色核的数目。计算海马CA1 区TU‐NEL阳性核（棕色）的百分比。

1.8 免疫荧光法检测5-HT2A受体蛋白表达 海马组织切片置于3%过氧化氢溶液中浸泡15 min，PBS洗涤，柠檬酸钠溶液进行抗原回收；山羊血清室温下封闭30 min，弃血清，加入5-HT2A 受体抗体（1∶100），4 ℃冰箱孵育过夜；PBS 洗涤，山羊抗兔IgG H＆L 抗体（Cy3，1∶200）室温下孵育30 min，PBS洗涤；添加DAPI染料10 min，PBS洗涤，中性树胶密封，荧光显微镜下观察。使用Image J软件分析光吸收值。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，随后进行多重比较检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠认知功能情况 与假手术组比较，Sevo-POCD 组和PRO-POCD 组逃避潜伏期延长，在第Ⅱ象限停留时间缩短，穿越平台次数减少（均P＜0.05），Sevo-POCD 组与PRO-POCD 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；DOI+Sevo-POCD 组逃避潜伏期短于Sevo-POCD 组，在第Ⅱ象限停留时间长于Sevo-POCD 组，穿越平台次数多于Sevo-POCD 组（均P＜0.05）；DOI+PRO-POCD 组逃避潜伏期短于PRO-POCD 组，在第Ⅱ象限停留时间长于PROPOCD 组，穿越平台次数多于PRO-POCD 组（均P＜0.05），见表1。

表1 5组大鼠认知能力比较 ±s

表1 5组大鼠认知能力比较 ±s

与假手术组比较，aP＜0.05；与Sevo-POCD 组比较，bP＜0.05；与PRO-POCD组比较，cP＜0.05。

2.2 神经功能评分 与假手术组[（16.00±0.00）分]比较，Sevo-POCD 组[（2.46±0.56）分]和PRO-POCD组[（3.18±0.42）分]Garcia 神经功能评分降低（P＜0.01），而Sevo-POCD 组与PRO-POCD 组比较，差异无 统 计 学 意 义（P＞0.05）；DOI+Sevo-POCD 组[（9.23±0.80）分]Garcia神经功能评分高于Sevo-POCD组（P＜0.05），DOI+PRO-POCD 组[（7.96±0.57）分]Garcia 神经功能评分高于PRO-POCD 组（P＜0.05）。

2.3 大鼠海马组织结构变化 假手术组中，海马CA1 区神经元排列规则、紧密，具有清晰的细胞边界，且细胞形态规则，细胞核大而圆，细胞质丰富；其余4 组的海马区神经元细胞严重受损，细胞排列疏松紊乱，细胞间隙增大，细胞数目减少，细胞质减少，细胞核固缩严重，且细胞形态不规则，见图1。

2.4 大鼠海马组织凋亡情况 与假手术组比较，Sevo-POCD 组和PRO-POCD 组神经元细胞凋亡率升高（P＜0.05），PRO-POCD 组与Sevo-POCD 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；DOI+Sevo-POCD组神经元细胞凋亡率低于Sevo-POCD 组（P＜0.05），DOI+PRO-POCD 组神经元细胞凋亡率低于PRO-POCD组（P＜0.05），见图2。

2.5 大鼠5-HT2A 受体蛋白表达 与假手术组比较，Sevo-POCD 组和PRO-POCD 组的5-HT2A 受体蛋白表达下调（P＜0.01）；另外，DOI+Sevo-POCD 组的5-HT2A 受体蛋白表达高于Sevo-POCD 组（P＜0.05）；且DOI+PRO-POCD组的5-HT2A受体蛋白表达高于PRO-POCD组（P＜0.05），见图3。

图1 大鼠海马CA1区组织HE染色（比例尺=50 μm，×400）

图2 TUNEL法检测大鼠海马CA1区神经元凋亡（×400）

图3 5-HT2A受体蛋白的荧光染色图

3 讨论

手术后出现中枢神经系统并发症，表现为精神错乱、焦虑、人格的改变以及记忆受损，被称为POCD。大型手术术后往往会表现出的POCD，包括记忆障碍，迷失方向和视觉空间能力，严重者可导致患者死亡和致残[11-12]。麻醉剂的使用已成为POCD 的关键因素。POCD 的发病率增加已阻碍了外科手术的发展。临床上，在Sevo 全麻下，患者的围手术期出现POCD 的概率明显增加；而PRO 作为常用的静脉麻醉药，起效和苏醒均较快，术后并发症出现的概率低，常用于麻醉的诱导和维持及危重患者的镇静。

Aβ沉积是各种原因诱发POCD 的共同途径，亦是POCD 形成和发展的关键因素[13]。研究表明，Se‐vo 可能对大鼠认知能力产生一过性影响，在1 周时间点为重要的节点，胆碱能系统发生紊乱，是造成POCD 的关键原因[8,14]；而PRO 使海马Tau 蛋白磷酸化水平发生变化诱导POCD 的发生[15]。本研究在对大鼠进行Sevo 或PRO 麻醉分别联合大鼠海马区注射Aβ1-40诱导大鼠发生POCD。通过水迷宫实验本研究验证Sevo 麻醉联合注射Aβ1-40导致大鼠的逃避潜伏期延长，且目标象限（第Ⅱ象限）的停留时间和穿越平台次数均减少（P＜0.05），而PRO 联合注射Aβ1-40得到类似的结果。表明Sevo 或PRO 麻醉联合Aβ沉积均可形成明显的POCD行为。

5-HT 已经被大量报道在抗抑郁和认知功能障碍中具有关键作用，而其5-TH2A 受体的在COPD中的作用则研究较少。尽管如此，仍有研究证实，在患有一般性和局部性脑缺血的动物模型中，5-HT2A 受体可以减轻脑损伤并改善功能恢复[16-17]。5-HT受体激动剂可以明显改善海马神经损伤，从而减轻认知功能障碍[18]。早期的报道显示，5-HT2A受体有益于激活海马胆碱能神经元[19]，从而可能参与认知功能障碍的调节作用[8,20]。本研究中，大鼠海马区5-HT2A 受体在Sevo 或PRO 麻醉联合海马区注射Aβ1-40诱导POCD 大鼠中的表达明显下调（P＜0.05）。表明5-HT2A 受体在POCD 发生过程中可能具有关键作用。

5-HT2A 受体激动剂处理后大鼠的逃避潜伏期明显缩短，第Ⅱ象限的停留时间和穿越平台次数均增加（P＜0.05）。进一步使用Garcia 神经功能评分评估大鼠的神经功能改善情况。Sevo 或PRO 麻醉联合海马区注射Aβ1-40诱导诱导下大鼠的神经功能评分明显降低，笼内活动和攀爬能力，四肢动作对称性、前肢运动对称性、触须反应均表现较差（P＜0.05）。注射5-HT2A 受体激动剂后，大鼠的运动能力、反应能力、左右协调性均明显改善（P＜0.05）。研究结果表明，5-HT 受体可能是POCD 治疗中合适的药物靶标[21]。除中枢神经组织外，5-HT 受体在大鼠海马齿状回、下丘脑、大脑皮层、脊髓中均有表达。另外，由于海马区神经元的功能是学习和记忆的基础，POCD 的发生与海马神经元凋亡有显著相关性[13]，在本研究中，使用Sevo和PRO 麻醉后，动物的神经元凋亡率明显升高（P＜0.05），本研究证实，5-HT2A 受体激活可抑制大鼠神经元的凋亡并改善脑损伤，并可能基于此原因从而改善COPD 大鼠的认知功能障碍。

综上所述，5-HT2A 受体激动剂通过激活5-HT2A受体改善手麻醉剂联合Aβ1-40诱导的POCD大鼠的认知功能和神经功能紊乱并抑制神经元凋亡。本研究为麻醉剂为关键的诱因的POCD治疗提供了临床研究依据。