氯胺酮调控Akt/mTOR信号通路对大鼠肺缺血再灌注损伤的作用机制研究*

杨明乾，陈雪萍，刘会长，熊 浪

（湖北省鄂州市中心医院 1.麻醉科；2.重症医学科，鄂州 436000）

肺缺血再灌注损伤（lung ischemic reperfusion injury，LIRI）是临床上的常见疾病，如心肺复苏、肺移植、单肺通气、体外循环和肺栓塞等[1]。LIRI 是一种发病率和病死率均较高的急性无菌性肺损伤，其发病机制包括氧化应激损伤、钙超载、内质网应激损伤、炎性损伤、自噬和凋亡等[2-4]。氯胺酮是一种常用的静脉麻醉剂，可扩张支气管，并抑制促炎细胞因子分泌，发挥抗炎作用[5]。有研究表明，氯胺酮预处理对肝脏缺血再灌注引起的急性肺损伤有明显的保护作用，可能是由核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）途径介导的[6]。NF-κB 是丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapa‐mycin，mTOR）下游关键的转录因子。Wen等[7]研究发现，Akt/mTOR 信号通路的活化能够减轻肢体缺血再灌注所致的急性肺损伤。本研究通过复制大鼠LIRI 模型，观察氯胺酮对LIRI 的影响，并通过检测Akt/mTOR 信号通路相关蛋白表达的变化，探讨氯胺酮对大鼠LIRI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠，体重230～250 g，购自吉林农业大学，动物使用许可证号：SYXK（吉）2018-0023。所有动物在安静清洁的环境中饲养，温度（22±2）℃，相对湿度（55±15）%，12 h明暗交替，自由摄食饮水，适应性喂养1周。实验过程遵循“3R”原则。

1.2 药物和主要试剂

氯胺酮，货号：N-036，购自美国Sigma 公司；白细 胞 介 素（interleukin，IL）-6 试 剂 盒（货 号：ab178013）、IL-1β 试剂盒（货号：ab197742）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）试剂盒（货号：ab181421）均购自英国Abcam 公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（货号：A003-1-2）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒（货号：A044-1-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dis‐mutase，SOD）试剂盒（货号：A001-3-2）、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（货号：A007-1-1）均购自南京建成生物工程研究所；苏木精－伊红（HE）染色试剂盒（货号：C0105）、TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1091）购自上海碧云天生物科技有限公司；一抗磷酸化（phosphorylated，p-）Akt（货号：4060）、pmTOR（货号：5536）、p-NF-κB p65（货号：8242）、内参β-actin（货号：58169）及二抗（货号：7076）均购自美国Cell Signaling公司。

1.3 实验仪器

小动物呼吸机购自加拿大Mexico公司，光学显微镜购自日本Nikon 公司，酶标仪、蛋白电泳仪、半干转膜仪购自美国Bio-Rad 公司；凝胶成像仪购自杭州Miulab公司。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠LIRI模型的制备 按照文献[8]的方法，首先用1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉大鼠，待充分麻醉后，静脉注射生理盐水（10 mL/kg/h），行气管插管，连接到小动物呼吸机上进行机械通气，调整参数：呼吸频率60 次/min，潮气量1.5 mL/kg，呼吸比（I∶E）1∶2.5，吸入氧浓度（FiO2）99%；在大鼠第四肋间打开胸腔，钝性分离皮下组织，在呼气期暴露并切开胸膜，暴露左侧胸腔，仔细分离左侧肺门，显露气管；经尾静脉注入300 U/kg 肝素，10 min 后，用无创性血管夹夹闭左肺门建立缺血模型，60 min 后松开血管夹，恢复左肺通气与供血120 min。

1.4.2 动物分组 将60只SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、氯胺酮低剂量组、氯胺酮中剂量组和氯胺酮高剂量组，每组12 只。假手术组仅开胸，不夹闭左肺门。其他4 组建立LIRI 大鼠模型。氯胺酮低、中、高剂量组大鼠于阻断左肺门静脉前，分别于尾静脉注射2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg 的氯胺酮[9]。

1.4.3 血清炎性因子含量检测 再灌注120 min后，各组大鼠心脏取血，离心，取上层血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.4.4 大鼠肺组织湿重/干重（W/D）比值 实验结束后麻醉下处死大鼠，取出完整左肺组织，称湿重，再置于80 ℃干燥箱中烘烤24 h，称干重，计算肺组织W/D。

1.4.5 肺组织病理变化 取左肺组织，置于甲醛中固定24 h，脱水透明，浸蜡包埋，切片，行HE 染色，光学显微镜下观察肺组织的病理学变化。

1.4.6 肺组织MDA含量和SOD、CAT、MPO活性测定 取左肺组织，制成组织匀浆，按照试剂盒说明书，检测肺组织中MDA 含量和SOD、CAT、MPO 活性。

1.4.7 肺组织细胞凋亡检测 采用TUNEL 法对肺组织的细胞凋亡情况进行检测，每只大鼠随机选择5张切片，每张切片选择5个具有代表性的高倍镜视野（×400），记录TUNEL 染色阳性细胞（即凋亡细胞）数，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.4.8 肺组织p-Akt、p-mTOR、p-NF-κB p65 蛋白表达测定 提取肺组织总蛋白，BCA 法检测蛋白含量，SDS-PAGE 分离蛋白，转膜，一抗（p-Akt、pmTOR、p-NF-κB p65，稀释倍数为1∶500）4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜后孵二抗（稀释倍数为1∶1 000），室温下孵育2 h，ECL 显色，使用凝胶成像系统拍照，Im‐age J 软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin 蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氯胺酮对LIRI大鼠肺组织W/D的影响

与假手术组（3.64±0.38）比较，模型组大鼠（6.49±0.51）肺组织W/D 比值显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，氯胺酮各剂量组[（5.31±0.34）、（4.19±0.29）、（3.75±0.31）]肺组织W/D 比值显著降低（P＜0.05）。

2.2 氯胺酮对LIRI大鼠血清炎性因子含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，氯胺酮各剂量组血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量显著降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性，见表1。

表1 5组大鼠血清炎性因子含量比较 pg/mL，±s

表1 5组大鼠血清炎性因子含量比较 pg/mL，±s

与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与氯胺酮低剂量组比较，cP＜0.05；与氯胺酮中剂量组比较，dP＜0.05。

2.3 氯胺酮对LIRI大鼠肺组织MDA 含量和MPO、SOD、CAT活性的影响

与假手术组比较，模型组大鼠肺组织MDA 含量、MPO 活性显著升高（P＜0.05），SOD、CAT 活性显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，氯胺酮各剂量组肺组织MDA 含量、MPO 活性显著降低（P＜0.05），SOD、CAT 活性显著升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性，见表2。

2.4 氯胺酮对LIRI大鼠肺组织病理变化的影响

假手术组大鼠肺组织结构清晰完整，无明显充血、水肿及炎性浸润；模型组大鼠肺组织结构损伤严重，肺间质充血水肿，肺间隔变厚，大量炎性细胞浸润和红细胞渗出；氯胺酮各剂量组大鼠肺组织损伤程度明显减轻，仅有少量炎性细胞浸润，见图1。

2.5 氯胺酮对LIRI大鼠肺组织细胞凋亡率的影响

与假手术组[（3.18±1.15）%]比较，模型组[（39.67±5.49）%]大鼠肺组织细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与模型组[（39.67±5.49）%]比较，氯胺酮低剂量组[（31.53±4.25）% ]、氯胺酮中剂量组[（23.92±3.68）%]、氯胺酮高剂量组[（11.38±2.32）%]肺组织细胞凋亡率显著降低（均P＜0.05），见图2。

2.6 氯胺酮对LIRI 大鼠肺组织p-Akt、p-mTOR、p-NF-κB p65蛋白表达的影响

表2 5组大鼠肺组织MDA含量和MPO、SOD和CAT活性比较 ±s

表2 5组大鼠肺组织MDA含量和MPO、SOD和CAT活性比较 ±s

与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与氯胺酮低剂量组比较，cP＜0.05；与氯胺酮中剂量组比较，dP＜0.05。

图1 大鼠肺组织HE染色图（×100）

图2 大鼠肺组织TUNEL染色图（×100）

与假手术组比较，模型组大鼠肺组织p-Akt、pmTOR 蛋白水平显著降低（P＜0.05），p-NF-κB p65蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，氯胺酮各剂量组肺组织p-Akt、p-mTOR 蛋白水平显著升高（P＜0.05），p-NF-κB p65 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图3、表3。

图3 大鼠肺组织蛋白电泳图

表3 5 组大鼠肺组织p-Akt、p-mTOR、p-NF-κB p65 蛋白表达水平比较±s

表3 5 组大鼠肺组织p-Akt、p-mTOR、p-NF-κB p65 蛋白表达水平比较±s

与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与氯胺酮低剂量组比较，cP＜0.05；与氯胺酮中剂量组比较，dP＜0.05。

3 讨论

LIRI 是缺血组织器官血流恢复后，组织损伤加重，甚至不可逆转的病理现象[10]。主要特征是微血管通透性增加、肺血管阻力增加、肺水肿和氧合功能受损，可由创伤、肺栓塞、肺血栓形成或外科手术（如肺移植或体外循环心胸手术）引起[11]。本研究通过无创性血管钳夹法建立大鼠LIRI 模型，结果发现，LIRI 模型组大鼠肺组织结构损伤严重，肺间质充血水肿，肺间隔变厚，大量炎性细胞浸润和红细胞渗出，血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量及肺组织W/D、细胞凋亡率、MDA 含量、MPO 活性显著升高，SOD、CAT 活性显著降低（P＜0.05），说明LIRI 大鼠肺组织损伤严重，且伴随严重的炎症反应及氧化应激反应，揭示模型构建成功。

大量的研究发现，氯胺酮对肺组织具有明显的保护作用。氯胺酮可通过抑制HMGB1-RAGE水平减轻脂多糖引起的肺损伤[12]。在研究机械通气引起的急性肺损伤患者后发现，氯胺酮可明显改善患者的血气和肺功能指数[13]。LIRI 大鼠经氯胺酮处理后，大鼠肺组织损伤程度明显减轻，仅有少量炎性细胞浸润，肺组织W/D 比值、细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），说明氯胺酮可减轻LIRI 大鼠肺损伤程度，减轻肺组织病理变化。大剂量的氯胺酮通过抑制组织中TNF-α、IL-6 的表达降低急性肺损伤程度[14]。本研究中，氯胺酮各剂量组血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量显著降低（P＜0.05），结果与其一致，说明氯胺酮可显著抑制炎性因子的表达，减轻肺组织损伤。肺中性粒细胞（pulmonary polymorphonu‐clear neutrophil，PMN）聚集是LIRI 炎症反应的罪魁祸首[15]。MPO 是中性粒细胞中唯一存在的还原酶，其活性可以用来反映PMN 积聚的程度[16]。MDA 是脂质过氧化的代谢产物，而SOD和CAT是细胞内的一种关键抗氧化酶。在氯胺酮处理后，肺组织MDA 含量、MPO 活性显著降低，SOD、CAT 活性显著升高（P＜0.05），表明氯胺酮可减少LIRI 大鼠肺组织的氧化应激反应，保护肺组织功能。

PI3K/Akt 通路可参与响应细胞外信号刺激生存和生长，通路的激活对于产生炎症介质和促炎细胞因子对细胞外信号的反应非常重要[17]。mTOR 为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可以感知和整合各种环境和营养刺激，包括生长因子、细胞压力和能量水平。NF-κB调节先天和获得性免疫反应以及炎症相关基因的表达[18]。mTOR 和NF-κB 都是Akt 的下游关键效应因子。适当抑制PI3K/Akt/mTOR 将激活NFκB，释放随后的炎性介质和促炎细胞因子[19]。有研究指出可通过Akt/mTOR/NF-κB 途径抑制炎症[20]。在大鼠LIRI 模型中发现，肺组织p-Akt、p-mTOR 蛋白水平显著降低，p-NF-κB p65 蛋白水平显著升高（P＜0.05），说明Akt/mTOR信号通路与LIRI大鼠炎性反应增强有关。右美托咪定治疗可以通过在转录水平上激活PI3K/Akt 信号通路来减轻肺缺血再灌注损伤[8]。LIRI 大鼠在氯胺酮药效作用下，肺组织p-Akt、p-mTOR 蛋白水平显著升高，p-NF-κB p65蛋白水平显著降低（P＜0.05），表明氯胺酮可激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路，减轻肺组织的炎症反应。

综上所述，氯胺酮可能通过激活Akt/mTOR 信号通路，减少炎症及氧化应激反应，减轻肺组织病理变化，保护LIRI 大鼠肺功能。然而，LIRI 的病理过程比较复杂，氯胺酮对肺组织的作用机制仍需进一步研究。