马兜铃酸I磁性分子印迹聚合物的制备*

陆雅婷，苏志恒，梁永红

（广西医科大学药学院，南宁 530021）

马兜铃酸类物质（aristolochic acids，AAs）是常见于马兜铃科马兜铃属和细辛属植物中的硝基菲类化合物，主要包含马兜铃酸（aristolochic acid，AA）I、II、III 和IV 等组分，其中以AAI 的分布最为广泛[1-3]。早在上个世纪，AAI 就被证实具有明显的肾毒性，临床上表现为肾间质纤维化、肾小管坏死，被冠以“马兜铃酸肾病”[4-5]。同时也有研究论证AAI作为潜在的致癌物质，可引起肾癌、肝癌、淋巴癌等[6-8]。由于AAI 暴露所引起的全球公共卫生问题引起了广泛的关注，许多国家和地区叫停了马兜铃科中草药及其制剂在临床上的使用。然而，在中医药悠久的发展进程中，该类中草药及其制剂在抗炎、抗疟疾和降血糖方面表现出了举足轻重的作用[9-11]。因此，如果能实现对中药材中AAI 的捕获、富集、去除将有助于达到减毒存效的目的，与此同时，建立AAI 快速检测的方法也将进一步推动AAI的毒理学研究，有助于临床上对“马兜铃酸肾病”的早期预防诊断，提高用药安全性和有效性。

基于此，本研究以四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4）为载体，甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交联剂，2,2－偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂制备AAI 磁性分子印迹聚合物（MIPs），依据该聚合物特异性吸附、易于分离等特点实现AAI快速富集以及专一、简便检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

AAI（批号：MUST-19031511，纯度大于98%）购自成都曼思特生物科技有限公司；Fe3O4、MAA、AIBN、EGDMA、丙烯酰胺（AM）、硅酸四乙酯（TEOS）、3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（3-MPS）、2-乙烯吡啶（2-VP）均是分析纯级别，购于上海阿拉丁试剂有限公司。质谱级别乙腈和磷酸分别购于阿达玛斯试剂有限公司和天津市大茂化学试剂厂。所有的实验用水均通过净水系统（Milli-Q）进行纯化。实验用的主要仪器有LC-1260Ⅱ型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；傅立叶变换红外光谱仪（美国珀金埃尔默公司）；扫描电子显微镜（捷克TESCAN）；XS205DU 十万分之一电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；超声清洗器（上海冠特超声仪器公司）；离心机TDL-5A（上海菲恰尔分析仪器有限公司）。

1.2 AAI MIPs的制备

1.2.1 Fe3O4@SiO2颗粒的合成 将600 mg Fe3O4颗粒分散在60 mL 异丙醇-超纯水（5∶1，v/v）的体系，超声分散20 min，分别加入10 mL 氨水（25%，w/w）、4 mL TEOS，室温反应12 h，得到黑色产物。反应结束后用磁铁吸住产物，除去溶剂。用超纯水和甲醇反复洗涤数次以除去未反应的试剂，最后得到Fe3O4@SiO2颗粒。将颗粒置于50 ℃的真空下干燥，备用。

1.2.2 Fe3O4@SiO2@MPS 颗粒的合成 将600 μL 3-MPS分散在120 mL含10%乙酸溶液的超纯水中，室温下持续机械搅拌5 h。上述溶液充分混匀后加入750 mg Fe3O4@SiO2颗粒，60 ℃下机械搅拌反应6 h。反应结束后用超纯水将得到的产物洗涤直至中性，40 ℃的真空下干燥24 h，备用。

1.2.3 Fe3O4@SiO2@MPS@MIPs（MIPs）和Fe3O4@SiO2@ MPS@ NIPs（NIPs）的合成 将0.026 mmol的AAI 溶于40 mL 乙腈—甲醇（3∶1，v/v）的体系，充分溶解后加入0.104 mmol MAA，室温下反应5 h 形成预聚物，再将50 mg 的Fe3O4@SiO2@MPS、0.52 mmol EGDMA 和0.06 mmol AIBN 分散在上述溶液中。混合溶液在超声浴中脱气15 min 后用氮气鼓泡10 min 以除去氧气。系统密封，在氮气保护装置下，65 ℃水浴反应24 h。用磁铁收集得到的黑色产物，依次用甲醇—乙酸溶液（9∶1，v/v）洗涤得到的聚合物，直至滤液通过HPLC检测不到有AAI的存在。非分子印迹聚合物（non molecular imprinted poly‐mers,NIPs）的合成方法与MIPs的合成方法类似，只是不需要加入模板分子AAI。

1.3 合成条件的优化

1.3.1 模板分子、功能单体和交联剂比例的选择 实验中固定MAA为功能单体、EDGMA为交联剂，考察模板分子、功能单体和交联剂的用量比例，分别为1∶4∶20、1∶2∶20、1∶6:20、1∶4∶10、1∶4∶40。

用印迹效率因子（IF）评价不同比例的印迹效率，定义为IF=QMIPs/QNIPs。其中QMIPs 和QNIPs 分别代表MIPs 和NIPs 的吸附容量，吸附量Q（μg/mg）采用下面公式计算：Q=（C0-C）×V/m,式中：C0和C分别为吸附前、后溶液中AAI 的浓度，单位μg/mL；V为加入的AAI 标准工作溶液的体积，单位mL；m 为加入MIPs或者NIPs的质量，单位mg。

1.3.2 功能单体的选择 根据“1.3.1”项实验的结果固定模板分子、功能单体和交联剂之间的用量比例，考察不同种类的功能单体对印迹效率的影响。实验中选择的功能单体有MAA、AM、2-VP，用IF评价不同功能单体的印迹效率。

1.3.3 溶剂的选择 溶剂又称致孔剂，在MIPs的制备过程中溶剂应有助于模板分子和其他反应物的溶解，从而使聚合物具有孔状结构，便于模板分子进入识别位点。常用的溶剂种类有乙腈、甲醇、丙酮、氯仿等，在预实验中发现AAI 易溶于乙腈-甲醇（3∶1,v/v）、丙酮、氯仿，因此本次实验考察以上几个溶剂种类对印迹效率的影响，用IF 评价不同溶剂的印迹效率。

1.4 MIPs和NIPs的表征

采用扫描电镜（SEM）、傅立叶红外变换光谱仪（FT-IR）表征得到的MIPs和NIPs形貌以及结构。

1.5 AAI MIPs吸附性能的研究

1.5.1 AAI 标准溶液的配制 精密称定15 mg AAI于50mL 容量瓶中并用甲醇溶解定容，配成300 μg/mL AAI 标准储备溶液。再依次量取适量储备液，配成25～200 μg/mL AAI标准工作溶液。

1.5.2 AAI 在C18柱上的色谱测定条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相条件：0.1%磷酸水溶液:乙腈=50∶50；流速：1.0 mL/min；检测器：紫外检测器；进样体积:10 μL；检测波长：250 nm。

1.5.3 MIPs 和NIPs 的静态吸附试验将20 mg 的MIPs 或者NIPs 放置于10 mL 离心管，管内加入1.5 mL 甲醇，超声分散30 min 后加入2.5 mL 不同浓度的AAI 标准溶液。室温条件下将所有的离心管放置在恒温回旋振荡器振荡12 h，1 000 r/min 离心3 min 后再次用超声仪分散3 min。用磁铁移除MIPs 或者NIPs，取离心管上清液过0.22 μm 滤膜，用HPLC测定吸附后溶液中AAI的浓度。

1.5.4 MIPs 和NIPs 的动态吸附试验 将20 mg 的MIPs 或者NIPs 放置于10 mL 离心管，管内加入1.5 mL甲醇，超声分散30 min后加入2.5 mL 200 μg/mL 的AAI 标准溶液。室温条件下将所有的离心管放置在恒温回旋振荡器，分别振荡5 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，1 000 r/min离心3 min 后再次用超声仪分散3 min。用磁铁移除MIPs 或者NIPs，取离心管上清液过0.22 μm 滤膜，用HPLC测定吸附后溶液中AAI的浓度。

2 结果

2.1 AAI MIPs的制备

AAI MIPs 可以高度分散在超纯水中（图1a）。在外部磁铁的吸附下，黑色固体可以迅速聚集，从而达到固体、液体完全分离的效果（图1b）。固液分离的过程可以在10 s内完成。

2.2 合成条件的优化

2.2.1 模板分子、功能单体和交联剂比例的选择当模板分子、功能单体和交联剂的物质的量比为1∶4∶20时，AAIMIPs的印迹效果最好，见表1。

图1 合成的AAI MIPs在超纯水中的分散情况（a）和固液分离情况（b）

表1 模板分子、功能单体和交联剂不同物质的量比对AAI的印迹效率的影响

2.2.2 功能单体的选择 以MAA 作为功能单体得到的印迹效率明显高于选择AM 和2-VP 作为功能单体，见表2。

表2 不同种类的功能单体对AAI的印迹效率

2.2.3 溶剂的选择 以乙腈—甲醇（3∶1，v/v）作为实验的溶剂体系，可以获得较高的印迹效率，见表3。

表3 不同种类的溶剂对AAI的印迹效率

2.3 MIPs和NIPs的表征

从图2可以看到合成的两种粒子均近似球形团簇在一起，个体圆滑，粒径基本一致。图3 是MIPs和NIPs 的红外光谱图，二者的特征峰形基本一致，说明AAI 已经成功从聚合物中洗脱。图3 中1 082.94 cm-1、1 092.65 cm-1吸收峰属于Si-O-Si 的反对称伸缩振动，证明了硅烷偶联剂成功偶联在了Fe3O4纳米颗粒的表面，形成硅层；2 916.51 cm-1、2 920.96 cm-1振动峰对应于3-MPS 中C-H 的伸缩振动，说明双键基团成功接枝在Fe3O4@SiO2，为在其表面制备MIPs提供了条件。

图2 MIPs（a）和NIPs（b）的SEM 图

图3 MIPs和NIPs的红外光谱图

2.4 AAI MIPs吸附性能的研究

2.4.1 AAI标准溶液的配制 配制系列标准浓度的AAI 溶液后利用HPLC 进行检测，得到AAI 的标准工作曲线，如图4 所示，在25～200 μg/mL 范围内溶液浓度与峰面积之间有良好的线性关系，回归方程为y=5100.7CAAI+3739.6，其中CAAI为AAI 的浓度，相关系数R2为0.9996。

2.4.2 MIPs 和NIPs 的静态吸附试验 吸附量Q 与AAI 吸附浓度之间的关系曲线如图5 所示。对于MIPs，在AAI 浓度为25～75 μg/mL 范围内吸附量大体保持恒定，在75 μg/mL 之后随着AAI 浓度的增大，MIPs 的吸附量增大。该现象体现MIPs 对AAI存在物理吸附和特异性吸附两种性能。对于NIPs，其不存在AAI 特异性识别位点，对AAI 只有物理吸附，所以吸附效果显著差于MIPs。

图4 AAI的标准工作曲线图

图5 同一吸附时间MIPs、NIPs对不同浓度的AAI吸附容量

2.4.3 MIPs 和NIPs 的动态吸附试验 在不同时间点吸附量Q 与AAI 吸附浓度之间的关系如图6 所示。MIPs对AAI明显存在较高的吸附速度，且随着吸附时间的延长，MIPs 对AAI 的吸附量逐渐增大。在实验时间内，NIPs 对AAI 的吸附量大体保持恒定，未表现出良好的吸附性能。

图6 不同吸附时间MIPs、NIPs对同一浓度的AAI吸附容量

3 讨论

3.1 AAI MIPs的制备

Fe3O4纳米颗粒有以下特点：低毒性、良好的生物相容性、顺磁性[12]，其中，利用Fe3O4的磁性结合分子印迹聚合物的特异识别性可以对模板分子进行快速分离，所以本次研究首选Fe3O4作为载体材料。为了更好地形成表面印迹层，本研究还参考现有文献对Fe3O4进行一定的修饰[13]，即在磁球表面用硅壳进行改性，再进一步经溶胶－凝胶反应加入3-MPs在Fe3O4@SiO2表面形成双键基团。这样的修饰不仅可以提高纳米粒子的分散性，减少团聚现象，提高其可重复利用性，也使其更易于进行下一步的修饰，增加了磁性纳米粒子的应用范围。同时，双键基团的引入为模板分子与功能单体的聚合提供活性位点，更易于对AAI 的吸附。通过利用SEM、FTIR 表征得到的产物，确证了成功制备AAI MIPs，该聚合物不仅能对AAI 有吸附作用，还在外部磁铁的作用下快速实现了固液分离，说明所制备的AAI MIPs 保留有载体材料的磁性，同时也展现出MIPs对目标分析物的高强吸附性。

3.2 AAI MIPs合成条件的优化

实验发现，当选择EGDMA 为交联剂，MAA 作为功能单体，乙腈－ 甲醇作为溶剂，且AAI∶MAA∶EGDMA 物质的量比例为1∶4∶20 时，IF 为3.11，产生较好的印迹效果。EGDMA 可以通过AIBN 与MAA 形成良好的交联，从而将MAA 的功能基团在空间排列和空间方向上固定下来，更好的让AAI 镶嵌其中形成复合物。MAA 可以与AAI 发生较强的分子间作用力，形成氢键。氢键具有方向性和饱和性，可以采用物理或化学的方法将其断裂，将AAI完全从复合物中洗脱。AAI易溶于乙腈、甲醇、乙醇等有机溶剂中[14]，所以以乙腈－甲醇作为反应溶剂可以让AAI 高度分散其中，有利于AAI 与MAA 相互结合，形成均一稳定的复合物。一般而言增大功能单体的比例可以充分地预组装印迹分子，但过大浓度的功能单体有可能因为自身的聚合而减少特异性结合位点[15]。参照文献，模板分子、功能单体和交联剂的物质的量比以1∶4∶20为宜[16]，本次研究的结果也表明在这个条件下对AAI 有最大吸附效率。IF是评价MIPs印迹性能的重要参数，李小燕课题组制备的MIPs 以青蒿素为模板分子，其IF为2.16，对青蒿素表现出显著的吸附效果[17]；陈朗星等[18]以萘夫西林作为模板分子制备MIPs，其IF 为2.46，对萘夫西林有较高的吸附容量；本研究中得到的MIPs，其IF为3.11，与既往研究的结果比较，印迹效率因子更大，说明印迹效率更高。

3.3 AAI MIPs吸附性能的研究

在静态吸附实验中MIPs 的吸附量随AAI 浓度的增加而增加，动态吸附实验中发现MIPs的吸附量随吸附时间的增加而增加，且两个实验中均呈现NIPs 对AAI 的结合量明显低于MIPs。二者吸附差异的原因是NIPs 对AAI 的吸附是物理吸附，MIPs因内部有很多对AAI 的结合位点，因此其对AAI 的吸附量明显增大。这也进一步说明了合成MIPs 对AAI 具有较高吸附容量，有望应用于实际样品中AAI的富集和分析。