MicroRNAs调控细胞“上皮－间质转换”的靶基因及相关信号途径的研究进展*

王 婷，杨庆利，冷 静

（广西中医药大学 1.广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室；2.基础医学院，南宁 530200）

细胞的“上皮－间质转换”（epithelial-mesenchy‐mal transition，EMT）过程不仅关系到正常胚胎发育[1]、伤口愈合、组织纤维化等病理生理过程[2]，还与癌细胞从原发部位向远处组织或淋巴结转移的过程密切相关[3]。在EMT 过程中，上皮细胞失去连接性和极性，获得间充质细胞特性，使迁移和侵袭性增强[3-4]。调控EMT 发生的因素包括转录因子（如SNAIL、TWIST、ZEB 等）、代谢因素、microRNAs（miRNAs）及lncRNAs 等[5]。miRNAs是一类小的非编码RNA，通过调控靶基因的表达在多种疾病中发挥重要作用[6]。研究发现，miRNAs可靶向众多基因并抑制其表达，通过影响特定信号通路以及代谢通路对EMT 过程发挥促进或抑制的调控作用。本文主要从miRNAs 直接调控EMT 的靶基因和相关信号途径以及miRNAs表达调控等方面进行综述。

1 促进EMT 发生的miRNAs 靶基因及其信号通路

miRNAs 可靶向多种基因并抑制其表达，通过特定信号通路促进EMT 表型分子表达和肿瘤细胞迁移、侵袭或转移。研究发现，miR-10b 通过直接靶向E-钙粘蛋白（E-cadherin）基因CDH1 的3’-UTR区461和481位核苷酸，下调其mRNA 和蛋白表达，但不影响Snail、Slug、Twist 和ZEB 的mRNA 和蛋白表达。miR-10b 下调E-钙粘蛋白的同时，使N-钙粘蛋白（N-cadherin）表达增加，使喉癌Hep-2细胞获得间质纺锤样形态，导致其EMT 并促进其迁移和侵袭[7]。miR-10b 还能靶向包含CUB 和Sushi 的多结构域蛋白1（CUB and Sushi multiple domains protein 1，CSMD1）并抑制其在胃癌组织和细胞的表达，活化炎症与癌变相关的NF-κB 信号途径，上调c-Myc、细胞周期蛋白D1（CCND1）和众多EMT 标志物表达，在体外和体内促进HGC27、MKN74 胃癌细胞系的侵袭和转移[8]。再者，TGF-β1 诱导的miR-10b 还通过靶向凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）、同源性磷酸酶和张力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN），促进胶质母细胞瘤细胞EMT及其增殖和迁移[9]。

在乳腺癌细胞，miR-137 可直接与骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP7）mRNA的3’-UTR 结合而抑制其蛋白表达，促进乳腺癌细胞发生EMT 并增强其侵袭力[10]。另外，miR-182 通过靶向SMAD7 3’-UTR 抑制其蛋白表达，并促进乳腺癌细胞侵袭和骨转移。其机制为SMAD7 蛋白水平降低导致其失去抑制TGF-β 诱导的乳腺癌细胞EMT 的效应[11]。同时，miR-181c 也可靶向SMAD7 mRNA 的3’-UTR，通过调控TGF-β/EMT 信号途径影响骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。但miR-181c 是否通过抑制SMAD7 促进骨肉瘤细胞TGF-β/EMT 信号途径还不明确[12]。

在肺腺癌细胞，miR-214 直接与融合蛋白抑制因子（suppressor-of-fused，Sufu）的3’-UTR结合抑制其蛋白表达，通过Hedgehog 信号通路活化，促进肺腺癌细胞EMT 和转移[13]。而在非小细胞肺癌细胞中，miR-150 通过靶向FOXO4 mRNA 的3’-UTR 并抑制其表达，通过NF-κB/snail/YY1/RKIP 信号通路使E-钙粘蛋白表达降低，导致肺癌细胞EMT 和转移[14]。在肝癌细胞，miR-197 通过靶向轴抑制蛋白2（Axis inhibition protein 2，Axin-2）、裸角质膜同源蛋白1（Naked cuticle drosophila 1，NKD1）和Dickkopf相关蛋白2（Dickkopf-related protein 2，DKK2），激活Wnt/β-catenin 信号通路并促进肝癌细胞EMT 及其侵袭和转移[15]。在甲状腺癌组织中发现miR-483表达上调，同时Pard3 蛋白（partitioning-defective 3）表达下调。抑制miR-483可促进Pard3表达增加，并抑制TGF-β1 诱导的Tiam1/Rac1 信号活化以及未分化甲状腺癌细胞的迁移和侵袭[16]。

除上述以外，研究还发现晶状体上皮细胞Spry1 和Spry 2 缺乏可促进RTK 介导的细胞外信号调控激酶1/2 磷酸化和TGF-β 相关信号，导致上皮细胞EMT 和白内障发生。而miR-23b 能通过直接靶向SPRY2 促进晶状体上皮细胞增殖、迁移和EMT，在白内障发病中起促进作用[17-18]。除此之外，miR-494 与环孢素A 诱导的肾小管上皮细胞EMT密切相关。应用环孢素A 可导致miR-494 表达增加，后者靶向Pten的3’-UTR 区，抑制PTEN 蛋白表达[19]。PTEN 是PI3K/Akt 途径的负向调控因子，在该途径诱导的EMT 过程中发挥主要作用。PTEN下调导致PI3K/Akt 信号途径活化，促进EMT 发生[20]。而miR-494 是否通过调控Pten的表达影响肿瘤细胞EMT过程等问题还不明确。

2 抑制EMT 发生的miRNAs 靶基因及其信号通路

目前研究表明，miRNAs 除对EMT 发生过程发挥促进作用外，还通过靶向众多目标基因对细胞EMT发挥重要的抑制作用。研究发现，miR-98高表达可在体外抑制喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞EMT相关基因表达及其转移和侵袭性，并在小鼠体内显著抑制肿瘤的肺转移。miR-98 直接靶向高迁移率族蛋白A2（High mobility group A2，HMGA2）的3’-UTR 区并抑制其表达，导致受HMGA2 调控的介导EMT 发生的POSTN 蛋白的转录抑制[21]。另外，在临床膀胱癌组织标本及其细胞系中发现miR-124-3p下调并伴随整合素ITGA3上调，且miR-124-3p过表达可抑制肿瘤转移和侵袭。进一步研究证实，miR-124-3p 可直接靶向ITGA3，通过FAK/PI3K/AKT 和FAK/Src 信号通路并调控N-/E-钙粘蛋白表达来抑制EMT 过程[22]。临床研究还发现，乳腺癌组织和细胞miR-138-5p 表达显著降低并伴随菱形结构域蛋白1（rhomboid domain-containing protein 1，RHBDD1）表达升高。miR-138-5p 过表达可上调E-钙粘蛋白，同时下调N-钙粘蛋白和Vimentin 表达并抑制乳腺癌细胞EMT 及其体外迁移和侵袭。进而证明，miR-138-5p 通过靶向RHBDD1 发挥抑制EMT 的效应[23]。在前列腺癌组织中检测到miR-150低表达并伴随瞬时受体电位（transient receptor po‐tential，TRP）离子通道蛋白M4（TRPM4）高表达，进而证实miR-150 通过靶向TRPM4 影响肿瘤细胞EMT。在体外上调miR-150 可抑制TRPM4 表达并阻断β-catenin 信号通路活化，抑制肿瘤细胞EMT、增殖、迁移和侵袭，并在裸鼠体内抑制肿瘤生长和转移[24]。miR-202 在子宫内膜癌组织中表达降低。进一步研究明确了miR-202通过靶向成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）抑制子宫内膜癌细胞N-钙粘蛋白、vimentin 等表达以及EMT发生[25]。研究还发现，miR-488 水平在骨肉瘤和舌鳞状细胞癌组织和细胞中均显著下调，分别伴随水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）和活化转录因子3（activating transcription factor 3，ATF3）表达显著增加。进一步研究表明，miR-488 分别靶向AQP3 和ATF3，通过下调其表达分别抑制骨肉瘤和舌鳞状细胞癌细胞EMT及其增殖和侵袭[26-27]。

在肺癌方面，miR-132 和miR-373 在非小细胞肺癌（NSCLC）组织和细胞中表达均降低，二者分别通过抑制TGF-β1/Smad2 信号通路和白细胞介素-1受体相关激酶样蛋白2（IRAK2）和溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）基因对EMT 起抑制作用[28-29]。此外，miR-129 还通过靶向SRY 相关高迁移率族盒蛋白4（SOX4）的3’-UTR，抑制TGF-β诱导的NSCLC细胞系A549 的EMT 及其迁移和侵袭[30]。而miR-1246在A549、H1650 和H1299 肺癌细胞系的表达降低。进一步研究证实miR-1246靶向CXCR4并抑制其表达，通过阻断JAK/STAT 和PI3K/AKT 信号通路，促进E-钙粘蛋白表达，同时抑制N-钙粘蛋白、vimen‐tin、ZEB1 和Snail 表达，结果显著抑制肿瘤细胞EMT及其侵袭过程[31]。

受p53 诱导的miR-34 家族也能抑制肿瘤的EMT 及其早期转移。促进结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等EMT 和转移发生的IL-6R/STAT3 信号即通过后者直接抑制MIR34A基因第一内含子中保守的STAT3 结合位点发挥作用。人结直肠癌细胞p53 基因的活化能诱导miR-34 表达并下调IL-6R，从而干扰IL-6 诱发的肿瘤细胞迁移和侵袭[32]。此外，miR-370 和miR-33a 的表达在胃癌组织和细胞系中显著下调，分别伴随孕激素和脂肪酸受体4（progestin and adipoQ receptor 4，PAQR4）和Snail 家族转录抑制因子2（SNAI2）基因表达增加。通过生物信息学和荧光素酶报告分析分别证实了miR-370 和miR-33a 分别靶向PAQR4 和SNAI2 并抑制其表达，通过抑制Snail/Slug信号抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[33-34]。与此同时，miRNAs 对癌症干细胞及相关EMT 也具有调控作用，目前研究主要集中于EMT可以由多种细胞信号经由转录因子和信号传导途径引发的肿瘤相关分子和细胞机制。在胃癌细胞，miR-95 可上调肿瘤抑制剂双特异性磷酸酶5(dualspecificity phosphatase 5，DUSP5)，并阻断MAPK 通路及抑制癌症干细胞标记物(CD133、CD44、ALDH1和Lgr5)的水平，这表明miR-95 可抑制胃癌细胞EMT 及癌症干细胞表型表达[35]。而Shayimu 等[36]也证明miR-377 可通过调控转录因子ZEB2 (zinc fin‐ger E box-binding homeobox 2) 抑制结肠癌细胞EMT及癌症干细胞表型表达。

miRNAs 除抑制肿瘤细胞EMT 过程外，还通过抑制非肿瘤细胞EMT 参与众多疾病的发生和发展过程。例如，miR-200 家族（包括miR-200c/miR-141和miR-200a/miR-200b/miR-429 群）在抑制细胞EMT、肿瘤发展和组织纤维化过程中发挥重要作用。miRNA200a 可直接靶向β-catenin 基因CTN‐NB1的3’-UTR并抑制其表达，能抑制TGF-β1诱导的肾近曲小管上皮细胞HK-2的EMT和迁移。miR‐NA200a 可能在抑制肾间质纤维化过程中发挥重要作用[37]。miR-200b 通过靶向RhoE 的3’-UTR 区抑制其表达，使RhoE 不能发挥调节E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和vimentin 的表达的共功能，结果抑制宫颈癌HeLa 细胞的EMT 过程[38]。miR-141 在子宫内膜异位症患者在位和异位子宫内膜组织中表达降低。miR-141 能抑制TGF-β1 诱导的Ishikawa（ISK）细胞EMT、增殖和侵袭能力。SMAD2信号通路也参与该过程，但miR-141是否直接靶向SMAD2还不明确[39]。

研究发现，miR-204-5p 在继发性白内障组织中表达降低。miR-204-5p 能靶向SMAD4，通过抑制TGF-β/SMAD 信号而抑制晶状体上皮细胞（LECs）EMT 发生[40]。研究还发现，miR-30a 在糖尿病性白内障组织中的表达也降低，并伴随α-SMA 和vimen‐tin表达增加以及E-钙粘蛋白表达降低。miR-30a能靶向Snail同源物1（Snail homolog 1，SNAI1）使其下调而抑制该EMT 过程[41]。miR-204-5p 和miR-30a对于白内障防治具有潜在应用价值。此外，在正常组织中高表达的miR-29b除与肿瘤发生发展密切关联外，其表达降低还参与增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）的发病过程。与此同时，miR-29b 可靶向Akt2，逆转TGF-β1 诱导的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）EMT[42]。

受miRNAs 调控的影响细胞EMT 的靶基因种类众多，所涉及的信号转导途径复杂多样。事实上，miRNAs 除对EMT 发挥促进或抑制效应外，miRNAs 靶向特定基因还介导MET 的“逆转”过程，其机制与特定miRNAs（如miR-524-5p）靶向TP53INP1、ZEB2 和SMAD4 等基因有关，并与诱导性多能干细胞（iPSCs）的生成紧密关联[43]。而调控EMT 相关miRNAs 表达的因素较多，涉及代谢和表观调控等方面。近来研究发现，抑制EMT 发生的miR-200c 的表达受甲基化表观遗传调控。甲基CpG 结合蛋白2（MeCP2）与Suv39h1 蛋白结合协同介导miR-200c 基因启动子区组蛋白H3K9me3，抑制miR-200c 表达并促进神经胶质瘤细胞EMT 发生[44]。研究还发现，HCV 核心蛋白可促进DNA 甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）表达并导致HCV 相关肝内胆管癌中miR-124 的表达降低，该过程也与靶基因甲基化修饰密切相关[45]。另外，有研究还阐明了与神经嵴细胞EMT生理分化过程相伴随的“表观遗传-miRNAs-基因”负反馈调控机制。该研究发现，DNA 从头甲基转移酶DN‐MT3B 和SNAIL2蛋白（可结合miR-203基因启动子抑制其转录）二者共同介导miR-203基因调控区Cp‐Gs 甲基化并使miR-203 的表达水平降低，使miR-203 靶向Snail2和Phf12基因3’UTRs 抑制其表达的作用降低，结果导致SNAIL2-PHF12 蛋白复合物产生并抑制Cad6b 蛋白表达，使神经嵴细胞发生EMT并出现生理迁移。该负反馈调控过程由SNAIL2 与miR-203的相互识别和结合实现[46]。

综上所述，全面了解miRNAs 正向和负向调控细胞EMT 发生有关的靶基因及其信号途径以及miRNAs 表达的调控对于认识恶性肿瘤和其他相关疾病发生、发展机制有重要意义。通过干预特定miRNAs 的表达可以影响细胞EMT 及其转移过程，对肿瘤及相关疾病治疗具有重要潜在价值。然而，特定细胞EMT 的发生可能受多个miRNAs 调控，其各自调控作用可能完全相反。研究调控特定细胞EMT 发生的miRNAs 表达谱及其网络调控机制可能是全面认识miRNAs 调控细胞EMT 病理生理过程，寻找实际可行的miRNAs 干预治疗靶点的重要环节。