中药贴膜对兔膝骨性关节炎关节液中IL-1、IL-6、THF-α、HA含量水平的影响

徐英杰，尹羽薇，付新，陈巍*，董清平，孙羽佳，张宇驰

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.鸡西矿业集团总医院，黑龙江 鸡西 158100；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；4.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

膝关节是骨性关节炎(OA)发病的最常见部位，以膝关节局部疼痛为主要症状，在行走或锻炼过程中加重，伴有关节僵硬、触痛、肿胀、发热等多种体征。本病为临床中老年人群的常见病，多发病[1]，随着现代医学的进步使人类的预期寿命大大延长，膝骨性关节炎的发病率也随之不断提高。导师董清平教授从事临床工作多年，对膝关节骨性关节炎的病因和发病机制有独到的见解，治疗本病积累了许多成功经验，临症中运用祖国医学理论，将“对症”与“对因”相结合，总结出经验方外敷治疗骨性关节炎，既能缓解临床症状，又能从根本控制病情发展，达到标本兼顾的治疗作用[2]。本实验采用现代生产工艺，将导师总结经验方药物有效成分提取，制成“中药贴膜”，用于治疗经Hulht造模方法制备兔膝骨性关节炎模型，通过检测治疗后实验动物关节液中IL-1、IL-6、TNF-α、HA的含量，进一步揭示中医药干预骨性关节炎关节退变的作用机理，为临床治疗骨性关节炎提供一种疗效可靠，简单易行，造价低廉，方便实用的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰白兔50只(合格证号SCXK黑2015-003)，3月龄，体质量2.0～2.5 kg，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供。

1.2 实验药物

中药贴膜由黑龙江中医药大学第一临床医学院制剂室在原方[3]基础上制备而成，其主要成分为骨碎补、川芎、续断、延胡索、冰片等。玻璃酸钠注射液由上海景峰制药股份有限公司生产(国药准字 H20000643)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备

将白兔正常饲养观察无异常后，采用Hulht造模法[4]，建立兔右膝关节骨性关节炎模型。

1.3.2 动物分组及给药方法

实验动物造模成功后，随机分成模型对照组、治疗1组、治疗2组、治疗3组，每组例数为10只，再选择同批次健康白兔作为正常组饲养。各组动物采用以下方式治疗：①治疗1组采用与中药贴膜剂成分相同经过普通粉碎方法制成药粉加入促透剂制成敷贴，进行右膝关节外敷治疗，1次/日，12 h/次，治疗6周。②治疗2组于术后1周开始右膝关节腔内注射玻璃酸钠0.25 mL，1次 /周，治疗5周。③治疗3组给予中药贴膜右膝关节外敷治疗，1次/日，12 h/次，治疗6周。④模型对照组应用医用橡皮膏，右膝关节帖敷治疗，1次/日，12 h/次，治疗6周。⑤正常组给予正常饲养。

1.3.3 Elisa法测定关节液内的IL-1、IL-6、TNF-α含量

治疗结束后，所有动物采用空气栓塞法处死，抽取各组动物治疗后右膝关节关节液，采用Elisa法测定关节液内的IL-1、IL-6、TNF-α含量，具体操作方法如下：①从冰箱内取出标本，待其自然解冻。打开试剂盒，常温放置，充分混匀试剂，注意避免大量气泡的产生。②样品在3 000 rpm条件下离心10 min，取上液待测。严格按说明书将标准品系列稀释，稀释前标准品需震荡混匀。洗涤缓冲液并以蒸馏水50倍稀释。③将标准品和待测样品做好标记，按顺序排列，每个标准品及空白对照均做复孔，样品根据数量尽量做复孔。④加入稀释好的标准品50 μL和待测样品50 μL于反应孔。立即加入50 μL的生物素标记的抗体。盖上模板，轻轻震荡混匀，37 ℃温箱温育45 min。⑤甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，震荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作4次。每孔加入酶标试剂，轻轻震荡混匀，37 ℃温箱温育30 min。⑥甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，震荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作4次。⑦每孔加入底物并震荡混匀，37 ℃温箱温育5 min，避免光照。取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，在酶标仪上测定各孔OD值。

1.3.4 放射免疫分析法测定关节液中HA含量

抽取治疗后各组实验动物关节液，按如下步骤测定关节液中HA含量：①将成500倍的关节液稀释成50 μL与125I标记物混合；将透明质酸放射免疫分析试剂盒中各标准品与125I标记物混合。②在37 ℃水浴标本，再加入一抗和二抗各100 μL，离心机离心15 min，转速3 500 r/min，弃上清液。③用免疫计数仪测定沉淀物的放射性并加以记录。

1.3.5 统计学处理方法

2 实验结果

2.1 Elisa法测定关节液IL-1、IL-6、TNF-α结果分析

经过6周治疗后，IL-1检测结果为正常组兔膝关节液中IL-1含量较低，仅为8.57 ng/L，模型对照组兔膝关节液中IL-1含量明显增高，约为正常组的37.2倍，治疗1组IL-1含量较模型对照组低，与模型对照组相比(P<0.01)，治疗2组和治疗3组在各治疗组中含量最低，与治疗1组相比有显著差异(P<0.01)，治疗2组、3组IL-1含量比较相差不大(P>0.05)，但均高于正常组(P<0.01)。

IL-6检测结果为正常组兔膝关节液中IL-6含量极低仅为0.09 ng/L，模型对照组兔膝关节液中IL-6含量在各组别中最高，达到248.54 ng/L，与正常组相比有极显著的差异(P<0.01)。应用传统中药治疗6周后，治疗1组兔膝关节液中IL-6含量下降至154.14 ng/L，与模型对照组相比有差异(P<0.01)。治疗2组、3组治疗6周后，膝关节液中IL-6含量下降明显，与治疗1组相比P<0.01。但治疗2组与3组比较相差不大(P>0.05)，高于正常组(P<0.01)。

TNF-α检测结果显示，模型对照组膝关节液中TNF-α含量明显升高，与正常组相比有显著差异(P<0.01)，具有统计学意义。应用传统中药治疗后，治疗1组实验动物膝关节液TNF-α含量较模型对照组有所降低(P<0.01)，具有统计学意义。应用玻璃酸钠、中药贴膜治疗后，治疗2组、3组实验动物右膝关节液TNF-α含量较模型对照组明显降低(P<0.01)，均优于治疗1组，其中治疗3组膝关节液TNF-α含量检测结果低于治疗1组(P<0.01)，具有统计学意义。结果见表1。

表1 各组实验动物关节液中IL-1、IL-6、TNF-α含量测定结果

2.2 放射免疫分析法测定关节液HA结果分析

实验结果显示，模型对照组关节液中透明质酸含量较空白对照组明显降低(P<0.01)，应用传统中药、玻璃酸钠、中药贴膜治疗后关节液中透明质酸含量较模型对照组均有提高(P<0.01),具有统计学意义。经过玻璃酸钠及中药贴膜治疗后关节液中透明质酸含量均较治疗1组高(P<0.05),具有统计学意义，其中应用玻璃酸钠治疗后关节液中透明质酸含量高于应用中药贴膜治疗(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组实验动物关节液中HA含量测定结果

3 讨论

本实验应用的中药贴膜其主要成分为延胡索、川芎、骨碎补、续断、冰片。方中延胡索：味辛、苦，性温。归肝、脾、心经。有活血，行气，止痛之功效。主治胸胁、脘腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛之症。中医认为，元胡辛散、苦泄、温通，既入血分，又入气分，既能行血中之气，又能行气中之血，气畅血行，通则不痛。《本草纲目》言：“延胡索专治一身上下诸痛，凡气血瘀滞，不通则痛，若气行血活，通则不痛，用之中的，妙不可言。”《本草经疏》曰：“延胡索，温则能和畅，和畅则气行；辛则能润而走散，走散则血活。血活气行，故能主破血及产后诸病因血所为者。”因此，本品为活血理气止痛之良药。临床证实本品配伍当归、川芎、桂枝、赤芍等药物用于治疗四肢血滞疼痛有较好的止痛作用，为中药中止痛良药[5]。研究证实，延胡索中可分离出多种生物碱，其中延胡索甲素、乙素、丑素、癸素均有镇痛作用，镇痛指数则以乙素较高，丑素次之，甲素较差，但均不及吗啡[6]。

川芎：味辛，性温。归肝、胆、心包经。有活血祛瘀，行气开郁，祛风止痛之功效。主治风寒湿痹，跌打损伤，胸胁疼痛，头痛眩晕，痈疽疮疡等症。《本经》记载：“川芎主中风入脑，寒痹、筋挛缓急……”。本品在临床为活血行气之首选要药，被称为气中血药。现代研究表明川芎中含有挥发油、生物碱、多糖等多种成分，其中主成分为藁本内酯、3-丁酜内酯、香桧烯、川芎嗪、阿魏酸、瑟丹酸、大黄酸、棕榈酸、香荚兰醛和亚油酸等[7]，其中川芎嗪能促进骨折家兔的骨折愈合和血肿的吸收[8]，且在体外实验显示对骨细胞增殖有促进作用[9]。

骨碎补：苦，性温。归肝、肾经。具有温补肾阳，强筋健骨，益虚损之功。主治跌扑闪挫，筋骨折伤，肾虚腰痛，耳鸣耳聋，牙齿松动等症，宜浸酒或捣散外用。《开宝本草》谓：“骨碎补主破血，止血，补伤折”。《症治要诀》云：“痢后下虚，不善调养，或远行，或房劳，或外感，致两足痿软，或痛或痹，遂成痢风，宜用独活寄生汤，吞虎骨四斤丸，仍以骨碎补三分之一同研，取汁，酒解服之，此亦从肾虚骨痿而治也”。现代研究表明骨碎补提取物中含有柚皮苷，β-谷甾醇，胡萝卜苷，肉桂酸，咖啡酸，原儿茶酸多种化合物[10],其中柚皮苷灌胃对实验性老年大鼠骨损伤愈合具有促进作用[11]。骨碎补水煎灌胃，治疗兔骨性关节炎，能够抑制软骨细胞凋亡，改善软骨细胞功能，推迟细胞退行性改变，降低骨关节病变率[12]，具有刺激骨关节软骨细胞代偿性增生作用，并能部分改善由于力学应力线改变造成的关节软骨退行性变的作用[13]。

续断：苦、辛，性微温。归肝、肾经。具有补肝肾，强筋骨，续折伤之功效。主治腰膝酸软，风湿痹痛，崩漏，胎漏，跌扑损伤等症。其中酒续断多用于风湿痹痛，跌扑损伤。本品辛温破散之性，善能活血祛瘀，既有甘温补益之功，又有壮骨强筋、续筋接骨、疗伤止痛之能，临床常用其治疗跌打损伤，瘀血肿痛，筋伤骨折。其甘温助阳，辛以散瘀，兼有补益肝肾，强健壮骨，通利血脉之功用于腰膝酸痛，寒湿痹痛。《本草正》云：“续断，用其苦涩。其味苦而重，故能入血分，调血脉，消肿毒、乳痈、瘰疬、痔痿，治金损跌伤，续筋骨血脉”。《药品化义》谓：“续断，苦养血脉，辛养皮毛，善理血脉伤损，接续筋骨断折，故名续断。”《本草正义》曰：“续断，其气温和，气味俱厚，故兼入气血，能宣行百脉，通利关节，凡经络筋骨血脉诸病，无不主之，而通痹起痿，尤有特长”。现代研究表明，续断中含有皂苷、生物碱、多糖、挥发油等多种有效成分，其中皂苷能够能明显提高间充质干细胞(MSCs)分化为成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素的含量[14]，是本品能够促进骨折愈合、防治骨质疏松的机制之一。

冰片：辛、苦，微寒。归心、脾、肺经。具有开窍醒神，清热止痛之功效。主治热病神昏，痉厥，中风痰厥，气郁暴厥，中恶昏迷，目赤，口疮，咽喉肿痛，耳道流脓等症。本品芳香走窜，具有良好的止痛作用，能清热而散郁火消肿而止痛。《会约医镜》云：“冰片治肢解疼痛”。现代药理研究证明冰片主要成分是近乎纯粹的右旋龙脑，具有抗炎止痛作用。而且冰片本身又是一种很好的透皮促进剂，川芎配伍冰片后，其所含的川芎嗪透皮吸收性能够被加强[15]。

IL-1、IL-6和TNF-α在OA软骨退变中起重要作用，这些细胞因子能够调节和刺激各种酶的活性，从而直接影响关节软骨的代谢。在多项研究中表明，大多数OA患者的滑液中可发现IL-1、TNF-α和IL-6，这些细胞因子都有明显的变化，它们通过对局部的刺激，使关节软骨退变加重[16]。

Wood等1983年首先在人类的关节炎病变滑液中发现了可促进软骨分解代谢的细胞因子，并通过检测鉴别出此因子是IL-1；Sabiston等在牛OA动物实验模型的滑膜中也发现了IL-1；Herman等在人的OA滑膜中也分离出了IL-1，证实滑膜中确实存在细胞因子。IL-1可由单核巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞分泌，其中以前者为主。在OA中，软骨细胞上1L-1感受器及IL-1本身的表达都有所增加。IL-1能够诱导人关节软骨细胞基质金属蛋白酶-3表达并增强其活性，还能刺激兔关节软骨细胞合成一氧化氮，并诱导基质金属蛋白酶基因表达，再依次促进基质金属蛋白酶-14、9和3合成，在mRNA和蛋白质两个水平上与转换生长因子-β和IL-4起结抗作用，并与Arg-Gly-Asp(精氨酸-甘氨酸一天冬氨酸)肽和P物质协同作用抑制II型胶原和蛋白聚糖的合成，动物关节内注射重组IL-1可复制出骨关节炎模型，注射IL-1拮抗剂又可阻断软骨基质成分的降解[17]。有关研究显示OA患者关节液中IL-1水平与骨关节炎软骨的破坏程度呈高度正相关[18]，即关节液IL-1水平越高，关节软骨的病变程度越重，因此关节液IL-1水平能作为一种临床早期诊断OA的参考性观测指标。本实验结果显示，正常组动物关节液中IL-1含量较低，而模型对照组实验动物关节液中IL-1含量却明显增加，表明骨性关节炎动物模型关节液中IL-1含量成增高趋势，传统中药外敷治疗膝骨性关节炎也起到了一定的疗效，表现为关节液中IL-1含量较模型对照组减少，但其效果与玻璃酸钠和中药贴膜治疗后相比有明显的差别，实验证实玻璃酸钠和中药贴膜可通过减少关节液内IL-1的生成,延缓骨关节炎病理过程发展,成为治疗膝关节骨性关节炎的重要原因。

IL-6主要由淋巴样和某些非淋巴样细胞产生，具有多种生物学活性。IL-6可增强IL-1和TNF-α的效应，诱导肝细胞合成多种急性时相反应蛋白。在活动期的OA患者血清及关节滑液中能检测到IL-6。OA患者的T细胞、B相胞、滑膜以及软骨细胞均可产生IL-6，并与疾病活动相关，骨性关节炎患者TNF-α与IL-6等协同作用，最终导致滑膜炎和软骨分解[19]。有研究表明，人膝关节骨关节炎患者滑液中IL-6浓度与关节破坏的X线分级相关[20]，提示IL-6也与骨关节炎的关节破坏相关。本实验结果显示了模型对照组动物膝关节液中IL-6含量较正常组明显增高，在应用不同治疗方法后，各治疗组动物关节液中IL-6含量均有一定的下降，其中以玻璃酸钠和中药贴膜的治疗效果最为明显。实验表明，中药贴膜和玻璃酸钠均可以通过下调关节液中IL-6含量而达到治疗骨性关节炎的作用。

TNF是一类能引起肿瘤组织出血和坏死的细胞因子，主要来源于外周血和滑膜的单核-巨噬细胞，参与免疫应答、抗肿瘤、介导炎症反应，参与内毒素休克及引起恶病质等，其中与关节炎相关的主要包括：诱导血管内皮细胞表达黏附分子，增强白细胞对内皮细胞的黏附；诱导分泌IL-1、IL-6、IL-8、CSF及基质金属蛋白酶等细胞因子和趋化因子，促进炎症发生；激活淋巴细胞和中性粒细胞，是T细胞激活的协同刺激因子；刺激B细胞产生抗体和诱导成纤维细胞增殖[21]。TNF-α能刺激软骨组胞产生大量的基质金属蛋白酶并增强其活性[22]，而对金属蛋白酶抑制因子无影响，使基质金属蛋白酶/金属蛋白酶抑制因子失平衡。TNF-α也能够抑制软骨中II型胶原和蛋白聚糖的合成，使软骨发生进行性破坏[23]，但其作用弱于IL-1，且它们之间有协同作用。本实验结果也显示模型对照组实验动物关节液中TNF-α含量较正常组明显增加，表明骨性关节炎关节液中TNF-α含量有增高趋势。各实验组经过治疗后，在减少关节液内TNF-α含量都起到了一定的效果，表明各治疗药物都可以通过降低关节液内的TNF-α含量，达到治疗骨性关节炎的目的。在各治疗组降低TNF-α含量的作用中，以中药贴膜的治疗效果最为明显，优于玻璃酸钠和传统中药治疗。

透明质酸(hyaluronic acid,HA)，又称玻璃酸，于1934年由Meyer等从牛眼玻璃体中分离而得名，它是关节液和软骨基质的主要组成成分。人体内的透明质酸主要由纤维母细胞、滑膜细胞和软骨细胞产生，其主要作用包括：参与细胞外液中电解质和水分的调节；关节和细胞间减震及润滑：屏障和抵御感染；参与修复创伤和钙化；促进血液凝固；澄清血脂；保持关节液的稳定；支持和稳定滑膜细胞和胶原支架；对痛觉的抑制；参与软骨修复等多种生理功能[24]。在OA发病过程中，由于基质金属蛋白酶和其他细胞因子的作用，致使关节滑液中产生较多的自由基，最终导致关节滑液中透明质酸分泌量减少，造成OA患者关节滑液中透明质酸的浓度、分子量和粘弹性均低于正常值。透明质酸含量下降使润滑和抵抗机械力作用的生物学功能产生障碍，作用于关节软骨的应力增加，导致软骨细胞损伤，滑膜合成透明质酸的功能低下；炎症过程中白细胞呼吸爆发产生的自由基可降解透明质酸，如氧自由基可破坏透明质酸黏变区，改变其性质，并使之断裂，滑膜炎症渗出增加又可继续造成透明质酸浓度降低，引发恶性循环。此外，骨性关节炎发病过程中关节内的积液增多，使关节内的透明质酸进一步被稀释，从而造成关节内的透明质酸含量相对降低，也是加重骨性关节炎的一个重要因素[25]。目前，研究显示骨性关节炎患者关节液中透明质酸的含量要明显低于正常人，因此在治疗骨性关节炎时常常配合采用关节内注射玻璃酸盐的方法[26]，起到了缓解关节疼痛，恢复关节功能的治疗作用。研究结果显示，模型对照组关节液中透明质酸含量明显低于正常组，表明骨性关节炎时，关节液中透明质酸处于较低水平。中药贴膜和玻璃酸钠都在治疗骨性关节炎过程中有较好的提高关节内透明质酸的作用，可以通过增加关节内透明质酸含量来达到治疗骨性关节炎的作用。关节内注射玻璃酸钠后，关节内透明质酸含量上升要高于中药贴膜治疗，明显高于传统中药治疗，因此注射玻璃酸钠疗法在增加关节内透明质酸含量的作用上要优于中药贴膜。

本实验将配置成功的中药贴膜贴剂应用于兔骨性关节炎模型，并将治疗结果与应用玻璃酸钠注射剂治疗进行对比研究，结果显示中药贴膜和玻璃酸钠都可以通过减低骨性关节炎动物模型关节液中IL-1、IL-6和TNF-α的含量来达到治疗骨性关节炎的目的。在改善关节液内透明质酸合成过程方面，研究结果显示玻璃酸钠在提高关节液内透明质酸的含量要优于中药贴膜，这与玻璃酸钠本身的药物性质有关，也可能是中药贴膜在治疗过程中要通过透皮吸收等一系列作用后达到治疗效果，从而使药物起效时间延长，亦或许是中药贴膜在透过皮肤表层组织后，在体内代谢还受其他相关因素的控制，从而致使中药贴膜在促进透明质酸生成的作用较玻璃酸钠低。相比而言，中药贴膜虽然在促进关节透明质酸生成方面弱于玻璃酸钠，但却可以从根本上对关节软骨的破坏因素进行(如MMP-1)进行干预[27]，从而从标、本两方面对骨性关节炎起到良好的治疗作用，其综合治疗结果要优于玻璃酸钠。本实验证实中药贴膜在治疗骨性关节炎过程中能够改善骨性关节炎动物模型关节液中IL-1、IL-6、TNF-α、HA等关键指标，为预防膝关节骨性关节炎的发生和治疗膝关节骨性关节炎提供直观的参考依据。