水曲柳BZR1基因克隆及其表达模式分析

纪欣童 于 磊 詹亚光*

（1. 东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2. 东北林业大学生命科学学院东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

油菜素内酯（BRs）是一种植物特有的类固醇激素，在植物生长和发育过程以及对多种生物和非生物胁迫方面具有关键的作用［1］。24-表油菜素内酯（24-epibrassinolide，EBR）在稳定低温胁迫下高山离子芥悬浮细胞膜系统的结构与功能方面发挥积极作用，从而保证细胞生理代谢的正常进行，以提高其抗寒能力［2］。BRASSINAZOLE RESISTANTANT1（BZR1）是调节BR 信号通路中的重要元件之一。BZR1与下游BR 调控因子的启动子区域结合并抑制BR 生物合成基因的表达以降低BR 水平，进而影响植物的生长［3～6］。因此，BZR1参与的负反馈调节是保持BR 作用平衡的关键机制。除介导BR 信号，BZR1在植物响应内部和外部刺激的过程中对于维持植物的正常生长和发育尤为重要［7］。拟南芥BZR1 结合ABA 诱导型转录因子ABA INSENSITIVE 5（ABI5）的启动子上几个G-box 顺式元件抑制ABI5表达降低植物对ABA 的敏感性，说明BZR1基因能够介导BR与ABA 之间的信号传导来促进植物响应生物和非生物胁迫［8］。在水稻中，BR 信号中BZR1直接促进OsmiR396d 的积累，OsmiR396d 通过调节不同靶基因的表达来控制BR 反应和GA 的生物合成，进而影响水稻的各种发育过程，提高水稻的产量［9］。拟南芥光受体光敏色素B（phyB）可直接与BZR1 的DNA 结合域相互作用，影响BZR1 在靶基因染色质上的累积进而影响BR 信号的转导［10］。Guo 等［11］发 现 在 香 蕉 果 实 成 熟 过 程 中MaBZR1 充当乙烯生物合成基因的转录阻遏物，延长香蕉果实成熟的时间，提高香蕉果实的品质和营养。BZR1 通过依赖RBOH1 的活性氧（ROS）信号调节番茄的耐热性［12］。Saha 等［13］研究了BZR家族转录因子在盐胁迫、干旱和ABA 处理后下的表达模式，检测了它们在不同器官中的组织特异性表达情况，结果表明BZR家族转录因子在抵抗各种胁迫中发挥多重作用。Lü 等［14］研究结果表明，在盐胁迫下BpBZR1在白桦中的过表达导 致H2O2和MDA 的 积 累 降 低，SOD 和POD 活 性升高，保持较高的光合强度和较低的叶绿素降解速率，说明BpBZR1基因的过表达提高了白桦对盐胁迫的耐受性。结合小泛素相关修饰物（small ubiquitin-like modifier，SUMO）是将环境信号转化为细胞信号的重要机制，在盐胁迫下，拟南芥植株BZR1 在细胞质中去SUMO 化，促进BZR1 靶向SUMO 蛋白酶ULP1a 的积累，从而抑制植株生长，而BR 处理可以促进ULP1a 降解，SUMO 化BZR1 积累并促进植株生长，增强植株响应盐胁迫的能力［15］。但在木本植物中对于BZR1的研究报道较少。

水曲柳（Fraxinus mandshuricaRupr.）木犀科（Oleaceae）白蜡树属（Fraxinus），是我国东北特有的白蜡树属树种之一，被列为国家二级保护的渐危种［16］。水曲柳在林业生产上具有重要的经济价值［17～18］。然而，水曲柳容易受到一系列生物和非生物胁迫的影响，包括土壤含盐量较高、寒冷时间长等因素。因此，研究关于水曲柳的生长及抗逆性的基因具有极其重要的意义。

本研究克隆得到水曲柳BZR1基因，并且命名为FmBZR1基因，进行生物信息学分析，并初步探究其在非生物胁迫及激素诱导下的表达模式。为深入了解FmBZR1基因在BR 信号通路的分子机理，挖掘和运用BR 对水曲柳的潜在作用提供理论依据。对提高水曲柳的品质以及水曲柳组培苗的扩繁具有极其重要的作用。揭示FmBZR1在非生物胁迫和激素信号下的表达特征。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的水曲柳种子取自东北林业大学实验林场，将种子萌发所形成的水曲柳幼苗置于恒温培养箱中培养，培养基质为V（营养土）∶V（蛭石）=3∶1，并调整培养箱维持温度23±2℃以及湿度为60%～80%，日照16 h，保证植物正常生长。水曲柳幼苗培养至15 d 时，取长势相近的植株分别用低温（4℃）、NaCl（200 mmol·L-1）、ABA（脱落酸，100 μmol·L-1）、IAA（吲 哚 乙 酸，100 μmol·L-1）和GA3（赤霉素，100 μmol·L-1）处理。盐胁迫使用浇灌法，对照组浇水处理；激素诱导使用叶面喷施方式，以0 h 未处理作为对照［19］。在正常条件下继续培养，分别于处理后1、3、6、12、24、48 h 取水曲柳幼根、茎、叶等组织作为样品，各3 次重复。-80℃冰箱保存。

1.2 主要试剂

pMD18-T 载体、反转录试剂盒均购自TaKaRa（大连宝生物工程有限公司）。引物合成及基因测序由上海生工生物有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1FmBZR1基因的扩增

以水曲柳叶片为实验材料，CTAB 法提取材料的总RNA。使用反转录试剂盒将提取的RNA 反转录成cDNA。利用本研究团队之前获取的水曲柳转录组，通过primer 5.0 软件设计引物，并送生物公司合成，引物序列如表1所示。回收纯化特异性扩增产物，pMD18-T 载体连接纯化产物，转化克隆进感受态细胞，送生物公司测序。

表1 FmBZR1基因序列克隆及荧光定量引物序列Table 1 Primers sequences for cloning FmBZR1 gene and fluorescent quantification

1.3.2FmBZR1基因的生物信息学分析

用DNAMAN 软件分析得到的FmBZR1基因的核苷酸序列，并推测其氨基酸序列。FmBZR1蛋白的理化性质、亲水/疏水性、信号肽的预测及分析以及跨膜结构预测和分析分别通过Protparam在线分析软件（http：//web.expasy.org/protparam/）、ProtScale 在 线 分 析 软 件（http：//web.expasy.org/protscale/）、SignalP 在线分析工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、在线工具TMPred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）进行分析。应用亚细胞定位在线分析工具Wolf psort（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）对Fm-BZR1蛋白进行分析。FmBZR1蛋白的二级结构应用GOR4 软 件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）分析。Fm-BZR1 蛋白的保守结构域利用NCBI 数据库Conserved Domain Seach Service（CD Search，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在线软件分析。FmBZR1 蛋白的三级结构通过Swiss Model 在线软件（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测。FmBZR1 氨基酸序列应用NCBI 数据库Blast 进行同源序列比对，以及搜索不同物种中的同源基因和蛋白。先将氨基酸序列利用ClusalX 进行多序列比对的分析，然后通过MEGA5.0软件Neighbor-Joining算法，构建系统发育进化树。

1.3.3 水曲柳BZR1基因在非生物胁迫和激素信号下的表达分析

水曲柳实生苗分别在低温（4℃）条件下和Na-Cl溶液浇灌条件下进行胁迫处理，分别喷施ABA、IAA、GA3三种激素进行诱导，处理时间为1、3、6、12、24、48 h；对照组不做任何处理，时间梯度同上。将水曲柳幼根、茎、叶等组织提取得到的总RNA反转录成cDNA，以此为模板进行荧光定量分析Fm-BZR1基因的表达量。内参基因为水曲柳微管蛋白基因α-Tubulin（Tu）［20］，引物见表1。PCR 反应体系如下：17.6 μL Master Mix，2 μL cDNA 模板，正反向引物各0.2 μL，用ddH2O 补足至20 μL。扩增反应利用Applied Biosystems7500 荧光定量PCR 仪进行，反应程序如下：95℃，30 s、95℃，5 s、60℃，34 s（共40 个循环）、95℃，15s、60℃，1 min、95℃，15 s。每份样品进行3 次重复。目标基因表达水平运用相对定量的2-ΔΔCt法计算［21］。

2 结果与分析

2.1 FmBZR1基因全长的鉴定

用FmBZR1基因的特异性引物和之前实验得到的cDNA 模板进行PCR 扩增。电泳结果显示，可扩增出大小在1 000 bp 左右并符合预期的特异性片段（见图1）。DNAMAN 软件预测水曲柳Fm-BZR1基因片段大小为984 bp，氨基酸序列长度推测为327个氨基酸（见图2）。

2.2 FmBZR1蛋白质理化性质的分析

利用Protparam 软件分析FmBZR1蛋白质理化性质。FmBZR1 蛋白相对分子质量为35 092.31；不稳定系数是71.93；理论等电点（PI）为8.46；总平均亲水性为-0.512，说明该蛋白为亲水性蛋白。利用SignalP 工具的神经网络预测FmBZR1 蛋白，结果表明该蛋白可能不存在信号肽。利用TMPred 分析FmBZR1 蛋白进行跨膜结构，结果表明，FmBZR1 蛋白中由内到外（i→o）4～24 位具有强烈的跨膜螺旋结构，说明该蛋白有由内到外的跨膜能力（见图3）。利用在线工具Wolf Psort 对Fm-BZR1 蛋白进行亚细胞定位预测，结果显示，该蛋白在分泌系统囊泡得分为48，在质膜得分为36，在细胞骨架得分为16，说明该蛋白主要存在于细胞质中。

2.3 FmBZR1蛋白质三级结构的分析

利用NCBI 数据库Conserved Domain Search Service（CD Search）在线分析软件，根据其催化残基、辅酶结合位点、底物结合位点、抑制剂结合位点、四聚体接口对水曲柳FmBZR1、FmBZR2 蛋白的保守结构域进行预测（见图4）。参考二级结构预测的结构域，运用Swiss-Model 在线分析工具对FmBZR1蛋白质的三级结构同源建模分析，并对建模结果采用分析软件Swiss-Pdb Viewer 进行处理。FmBZR1 蛋白质的三级结构同源建模结果表明其氨基酸序列与模板蛋白序列（麦芽糖周质结合蛋白BZR1 蛋白）相似度达到87.34%，与二级结构特定结构域吻合（见图5），且为螺旋—环—螺旋结构（见图6）。

2.4 FmBZR1氨基酸比对及系统进化树的构建

将NCBI 比对的氨基酸序列利用ClustalX 进行比对结果分析，结果表明，FmBZR1 蛋白 序列与11 个其他物种的BZR1 蛋白序列的相 似性较高（见图7）。再运用MEGA5.0 软件中的N-J算法构建系统进化树（见图8），结果表明，Fm-BZR1 蛋白与11 个物种的11 条蛋白序列相似性都比较高，大致分为两大类。其中，FmBZR1 蛋白与樟子松（Olea europaeavar.sylvestris）、芝麻（Sesamum indicum）、丹参（Salvia splendens）、茄子（Solanum lycopersicum）、烟 草（Nicotiana sylvestris）、辣椒（Capsicum annuum）的BZR1 蛋白亲缘关系比较近。

2.5 FmBZR1在非生物胁迫下的表达模式

水曲柳FmBZR1基因的表达量随着非生物胁迫处理的时间的延长发生显著变化（见图9）。在低温（4℃）处理后，FmBZR1基因的表达量随着处理时间的变化，呈现先上调后下调再上调的变化趋势。在处理6 h 后，FmBZR1基因的表达量达到上调表达峰值，最大的基因表达量为对照组的1.98 倍。在NaCl 处理后，FmBZR1基因的表达量出现先下调后上调再下调又上调的表达趋势，整体呈现为先下调后上调的趋势。在处理24 h 后，FmBZR1基因的表达量达到上调表达峰值，最大的基因的表达量是对照组的10.13 倍。结果表明，FmBZR1基因明显响应了低温（4℃）和NaCl 这两种非生物胁迫，其中，FmBZR1基因对NaCl 的响应更加强烈。

2.6 FmBZR1在激素信号下的表达模式

水曲柳FmBZR1基因的表达量随着不同激素信号处理的时间的延长发生显著变化（见图10）。在ABA 处理后，FmBZR1基因的表达量呈现先上调后下调的趋势，在处理3 h 后达到下调表达峰值，最低表达量为对照组的0.52 倍；在处理12 h 后达到上调表达峰值，最高表达量为对照组的4.26倍。在IAA处理后，FmBZR1基因的表达量呈现先下降又上升最后趋于平稳的趋势，在处理3 h 后达到最低表达量，为对照组的0.41 倍；在处理48 h 后达到上升表达峰值，最大表达量为对照组的1.44倍。在GA3处理后，FmBZR1基因的表达量在不同时长有显著差异，在处理3 h后，基因表达量最低，为对照组的0.50 倍；在处理24 h 后，基因表达量显著升高，为对照组的6.23 倍。结果表明，FmBZR1基因响应了ABA、IAA、GA3信号的刺激。

3 讨论

BZR1是BR 信号转导过程中的关键转录因子，BZR1的N 端有一个bHLH 结构域，可特异性结合到靶基因启动子区的BRRE 元件，对不同的靶基因的表达起到抑制或激活作用进而影响BR 信号的转导进而影响植物的抗逆性［22］。本研究通过生物信息学分析，确定FmBZR1 也有bHLH 结构，可以与下游基因启动子元件结合从而发生作用。当然，探究BZR1具体如何对下游基因产生的影响还需要进一步的实验验证。

BZR1可直接与WRKY54转录因子互作，也可以促进转录因子CBF（C-repeat binding factor）、WRKY6以及ABA 受体PYL6等编码基因的表达，表现出正调控拟南芥耐寒性［23］。寒冷和土壤含盐量一直都是限制植物生长的重要因素。水曲柳幼苗在寒冷环境下极易受冻害，生长受到抑制，因此研究低温对基因表达的影响极为重要。本研究在低温（4℃）处理后发现，FmBZR1基因表达量整体呈现先上调后下调再上调的趋势，在处理6 h 后，FmBZR1基因的表达量达到上调表达峰值，推测FmBZR1基因参与水曲柳抗寒胁迫中发挥重要作用。

通过对OsBZR1的过表达株系进行分析，发现BR 可显著诱导OsBZR1 去磷酸化，盐胁迫可以调控OsBZR1 蛋白的积累水平和磷酸化状态，BR 正调控水稻的耐盐性，盐胁迫通过抑制BR 合成来限制水稻的生长［24］。水曲柳作为东北地区“三大硬阔”树种之一，研究其基因对抗盐胁迫的作用尤为关键。本实验在NaCl处理后发现FmBZR1基因的表达量整体呈现为先下调后上调的趋势。在处理24 h 后，FmBZR1基因的表达量达到上调表达峰值，最大的基因的表达量是对照组的10.13 倍，说明FmBZR1参与响应盐胁迫。

已有多项实验结果表明，几种激素可以诱导BZR1基因表达。玉米ZmBES1/BZR1基因参与了玉米ABA 信号传导途径，且在不同器官和发育阶段以及对ABA 信号的响应表现出很大的差异［25］。当存在GA 时，DELLAs 降解而激活BZR1-PIF4-ARF6 模块表达以促进植物生长［26］。MdBZR1 和MdBZR1-2like 可 以 与MdGA20ox2和MdGA3ox1的启动子结合并增强它们在苹果中的表达从而加强GA 的生物合成，提高苹果的耐盐性［27］。本研究对FmBZR1在激素信号诱导下的表达模式进行了分析。结果发现，在ABA 处理后，处理3 h 后达到下调表达峰值，最低表达量为对照组的0.52 倍；处理12 h 后达到上调表达峰值，最高表达量为对照组的4.26 倍。在IAA 处理后，处理3 h 后达到最低表达量，为对照组的0.41 倍；处理48 h 后达到上升表达峰值，最大表达量为对照组的1.44倍。在GA3处理后，FmBZR1基因的表达量在不同时长有显著差异，在处理24 h 后，基因表达量显著升高，为对照组的6.23 倍。目前很多研究表明，BRs 整合了多种激素和环境信号的输入最终影响BR 调节基因的激活或抑制。BZR1家族成员为信号级联的组成部分，参与多种信号转导。然而，水曲柳Fm-BZR1转录因子的分子机制及其参与的BR 信号通路仍需进一步研究。

本研究通过基因克隆得到了FmBZR1基因，片段大小为984 bp，编码327个氨基酸。对水曲柳FmBZR1基因进行初步的生物信息学预测以及不同激素诱导下的表达模式的分析，结合水曲柳自身材料生长发育的特殊性进行综合验证，为进一步深入研究FmBZR1基因的功能以及BR 对于水曲柳的作用奠定了基础。后期工作要继续对水曲柳过表达植株、突变体植株或杂交种植株进行不同方面的研究，以探究FmBZR1基因所参与的信号通路对水曲柳生长发育的影响，进而为水曲柳的高效育种等提供理论支持与指导。