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分子对接和网络药理学探究银翘散治疗COVID-19机制

2021-03-02聂承冬马其华阎新佳

关键词:靶点复方通路

陶 悦,聂承冬,温 静,杨 洋,马其华,王 冲,阎新佳*

(1. 哈尔滨商业大学 药学院,哈尔滨 150076;2. 黑龙江省预防与治疗老年病药物研究重点实验室,哈尔滨 150076)

2019年12月末,一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)出现在我国武汉,并迅速蔓延.此病毒具有传染性强、潜伏期长、发病严重者可致亡等特点[1-2].清代吴瑭所著的《温病条辨》中银翘散原方为连翘、金银花、薄荷、淡竹叶、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、荆芥穗、甘草组成,主要用于新型冠状病毒引起的热毒袭肺证[3-4].银翘散被纳入国家卫生健康委员会办公厅《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》(试行第三、四、六版)中不仅推荐中药复方中有银翘散,而且其他推荐的中药配方,如金花清感等都以银翘散方为基础进行加减配伍[5-7].

血管紧张素转换酶II (ACE2)与冠状病毒入侵细胞密切相关[8],SARS患者的主要死因之一是(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)急性呼吸窘迫综合征,ACE2能有效控制小鼠ARDS的发生;SARS-CoV-2是冠状病毒复制所必须的酶,可作为有效的抗病毒药物靶点[9].鉴于以上,我们可以开发以ACE2和SARS-CoV-2为基础的药物去治疗新型冠状病毒.

本文主要针对病毒感染过程的关键靶蛋白血管紧张素转化酶II ACE2和SARS-CoV-2水解酶进行分子对接研究,深入研究银翘散方对新型冠状病毒的治疗机制.网络药理学是一个对多成分,多靶点,多途径进行分析,综合了基因组学,统计学等多学科和技术的新兴领域,网络药理学试图通过构建多个网络模型来探索潜在的机制和关系[10].本文利用分子对接与网络药理学研究中药复方银翘散,希望能为中药复方抗新型冠状病毒研究做出贡献.

1 实验方法

1.1 数据库与软件

本研究所涉及的数据库有PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、String (https://string-db.org/cgi/input.pl)、TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、SymMap(https://www.symmap.org/search/)和DAVID 6.7(https://david.ncifcrf.gov/);涉及的软件有ChemOffice 2018、GraphPad Prism 8.0.2、Cytoscape 3.7.2、AutoDockTools 1.5.6、PyRx 0.8和PyMO L2.1.1.

1.2 银翘散中主要成分筛选

基于中药系统药理学技术平台(TCMSP)数据库和SymMap数据库查询其所含化合物,以“连翘、金银花、薄荷、淡竹叶、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、荆芥穗、甘草”为关键词检索得到银翘散所含化学成分.

口服生物利用度(OB)描述口服给药后,成分从胃肠道和肝脏吸收和分布到体循环的速率和程度[11].类药物参数(DL)评估化合物作为药物的潜力[12],筛选条件为“DL ≥ 0.18、OB > 30%”[13],对银翘散所含成分进行筛选,得到银翘散的主要成分.

1.3 分子对接模拟

通过RCSB PDB数据库下载血管紧张素转化酶II ACE2(PDB 1R42)和SARS-CoV-2水解酶(PDB 6LU7)的蛋白晶体结构“PDB”格式文件.将“1.2”项下筛选出的主要成分通过PubChem下载其“SDF”格式,导入Chem3D 18.0进行优化,所为配体分子.配体分子导入PyRx软件进行能量最小化处理.蛋白导入Auto Dock Tools,移除配体、移除非蛋白分子、增加极性氢,原子类型设为Assign AD4 type.将已进行处理的配体分子导入PyRx软件的Ligands选项;蛋白导入Macromolecules选项,设置Exhaustiveness: 150,进行Run Vina等待计算结果.在输出结果中,RMSD lower bound和RMSD upper bound越低,Predicted binding Affinity(结合自由能)的数值越负,表明预测的配体与大分子之间的结合越好,打分系统使用Predicted binding Affinity[14-16].以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中的推荐抗新冠病毒药物为阳性对照,取阿比多尔(Arbidol)、洛匹那韦(Lopinavir)、氯喹(Chloroquine)、达芦那韦(darunavir)、羟氯喹(Hydroxychloroquine)、瑞德西韦(Remdesivir)、利巴韦林(Ribavirin)、利托那韦(Ritonavir),共8种药物.银翘散成分与阳性对照药的分子对接进行对照,筛选出主要的可能活性成分.

1.4 银翘散靶点蛋白筛选

基于TCMSP数据库、SymMap数据库和PubChem数据库对银翘散主要成分逐一配对靶点蛋白,并通过Uniprot数据库对靶点蛋白的名称进行去重,校正,只保留“homo sapiens”的靶点,作为银翘散主要成分靶点,下一步为富集分析做准备.

1.5 核心靶点富集分析与可视化

将银翘散的靶点蛋白导入string平台,设置种属为Homo sapiens,得到蛋白相互作用关系,下载为.TSV格式,导入Cytoscape,构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI),基于网络节点拓扑分析筛选出银翘散核心靶点.采用DAVID6.7数据库,对银翘散核心靶点进行基因生物过程(GO)富集分析与信号通路(KEGG)富集分析[17],并对通路进行可视化分析.

2 实验结果

2.1 基于分子对接的活性成分筛选

以OB>30%和DL ≥0.18为筛选指标,在数据库中筛选出银翘散方中各药材金银花15个、连翘20个、淡豆豉1个、桔梗4个、牛蒡子6个、荆芥穗7个、薄荷9个和甘草88个(淡竹叶由于无核心靶点,故筛去),去重,共计130个主要成分.将已收集的130个主要成分和8个阳性对照药与血管紧张素转化酶II(ACE2)和SARS-CoV-2水解酶进行分子对接,结果见表1、2.阳性对照药分子对接分数中氯喹为最低,分别为-6.80、-5.50,共有121个银翘散成分大于氯喹,说明银翘散各成分分子结合活性良好,并将这121个成分做为银翘散活性成分;阳性对照药分子对接分数中洛匹那韦为最高,分别为-9.30、-8.30,共有6个银翘散成分大于洛匹那韦,分别为Xambioona、Linarin、Isoglycyrol、Shinflavanone、Gancaonin H和bicuculline.

表1 阳性对照药的分子对接结果

表2 银翘散的分子对接结果

血管紧张素转化酶II(ACE2)与8个阳性对照的结合区域主要有2个,见图2 A和B区域;与银翘散130个主要成分的结合区域主要有4个,见图2 A、B、C和D区域.SARS-CoV-2水解酶与8个阳性对照的结合区域主要有2个,见图3 A和B区域;与银翘散130个主要成分的结合区域主要有4个,见图3 A、B、C和D区域.通过结合区域能说明中药复方通过多成分与多结合区域结合来发挥药理作用.表3中结合区域可以给后续分子研究提供一定的帮助.

图1 分子对接结果热图

图2 血管紧张素转化酶II的结合区域分析

图3 SARS-CoV-2水解酶的结合区域分析

表3 结合区域位点

2.2 核心靶点的富集分析与可视化

银翘散共计130主要成分,经数据库查询,去重一共520个靶点蛋白,将银翘散方的靶点蛋白导入string平台,通过蛋白相互作用获得415个蛋白,构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI),进行拓扑结构分析,以大于等于degree值2倍为筛选条件,筛选出银翘散方核心靶点99个.构建的药材-活性成分-靶点网络一共包括648个节点(8个药材节点,121个成分节点,519个靶点节点),2918条边,为下一步富集分析做准备.

采用DAVID数据库对银翘散方核心靶点进行GO和KEGG分析,保留其中FDR<0.05和P<0.05的通路.KEGG通路富集分析得到信号通路86条,涉及Pathways in cancer通路(E2F1, HSP90AB1, ADCY2, ADCY5和ERBB2等共48个靶标),Hepatitis B通路(E2F1, TNF, CXCL8, NFKBIA, NFKB1和TGFB1等共33个靶标),PI3K-Akt signaling pathway通路(HSP90AB1, NFKB1, AKT1, RAC1和PIK3CA等共31个靶标),HTLV-I infection通路(E2F1, TNF, ADCY2, ADCY5和NFKBIA等共27个靶标),cAMP signaling pathway通路(PPARA, PTGER3, ADCY2, DRD2和ADCY5等共26个靶标),等通路.利用Omicshare平台中高级气泡图可视化,结果见图4.GO功能富集分析得到生物过程条目99个、细胞组成条目12个、分子功能条目23个结果见图5.

图4 核心靶点的KEGG通路富集分析的前20个通路图

图5 核心靶点的GO分析的前20个通路

3 讨 论

银翘散对于患有新冠肺炎流感轻型、普通型患病者具有较好疗效,使用后,乏力干咳发热等症状均减轻,减少了轻型患者转重型、危重型的可能.对于轻型、普通型患病者,主要分为风寒袭表证,热毒袭肺证,其中热毒袭肺证临床主要表现为恶寒发热,头痛乏力,干咳少痰咽干痛,四肢肌肉酸痛等,可用银翘散清热解毒,宣肺透邪;对银翘散进行加减,配伍清瘟败毒散用于疏风解表,清热解毒;银翘散配伍麻杏石甘汤用于清瘟解毒,宣肺泄热,等等;对于重型、危重型患者,银翘散可以缓解部分症状,辅助其他药物使用[5].从《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》可以明显看出,中药复方初期的临床使用多以银翘散为基础进行加减配伍使用.

分子对接分析中,分别对血管紧张素转化酶II(ACE2)和SARS-CoV-2水解酶进行分子对接模拟.银翘散的130个成分分子对接分数中有121个大于阳性对照药的最低对接分数,说明银翘散复方与血管紧张素转化酶II和SARS-CoV-2水解酶结合活性很好.本研究还通过比对银翘散成分和阳性对照药二者的结合区域,发现银翘散的结合区域比阳性对照药多,说明中药复方通过多成分与多结合区域结合来发挥药理作用,且实际的结合活性可能比测出的结合数据更好.

通过数据库查询获得银翘散520个靶点蛋白,再通过蛋白相互作用获得415个蛋白,对蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)进行拓扑结构分析,筛选出银翘散方核心靶点99个.对核心靶点进行功能富集分析发现,它们多参与转录、信号转导,炎症反应等生物学过程,富集于与癌症、转录、免疫、炎症和病毒感染等相关的信号通路上,有众多与病毒相关的通路,还有Rap1信号通路[19]等与肺损伤[20]相关通路,说明银翘散本身复方可能对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和它引起的肺部疾病具有一定的活性作用.SARS-CoV-2病毒感染会导致剧烈的免疫反应和炎症风暴,严重者可导致死亡[21-22].银翘散的多靶点可能通过调控免疫反应(immune response)相关通路;调控炎症反应(inflammatory response)相关通路等,起到减缓过激免疫反应、减少炎症等作用.

综上所述,本研究先使用分子对接方法,从分子水平阐明了银翘散复方可能的分子作用区域,再使用网络药理学方法对银翘散的成分、靶点蛋白,生物学功能,通路进行系统研究,为银翘散复方治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和新型冠状病毒肺炎(COVID-19)研发药物和疫情防控等提供理论支持.

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