GeneXpert MTB/RIF系统联合抗酸涂片镜检在结核病诊断中的价值

李秋平，霍丽静，张雪丽，幺建立，钱宇，赵运胜，张丽娜，杨丹丹

1秦皇岛市第一医院，河北秦皇岛066000；2河北省人民医院；3秦皇岛市第三医院

WHO最新数据显示，我国的结核病发病率高达9%，耐药结核病高达14%。非结核分枝杆菌（NTM）广泛存在于自然界中，属条件致病菌；其所致疾病与结核病症状相似，但治疗不同。目前，缺乏准确和快速诊断仍然是我国结核病管理工作中的主要问题［1］。结核分枝杆菌（MTB）培养虽然特异性较高，但检测周期长，严重影响临床治疗及患者预后；抗酸涂片镜检快速简便，但灵敏度、准确度均较低。随着分子生物学诊断技术的发展，越来越多的分子诊断技术被用于结核病诊断。GeneXpert MTB/RIF系统（简称Xpert）是一种核酸扩增技术［2］，具有简单、快速、高灵敏度、高特异性等特点［3］。尽管2017年Xpert已被WHO认可，但我国尚未正式将其纳入到常规结核病诊断和管理中［4］。目前，Xpert在国内已开始有相关报道，但鲜见其与抗酸涂片镜联合检测的研究，本文探讨了两者联合检测在结核病诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年7月—2020年4月于秦皇岛市第一医院就诊的疑似结核病患者638例，男394例，女244例；年龄12～103岁，其中青年112例、中年156例、老年370例；共收集标本638份，其中肺泡灌洗液264份、痰液211份、组织液81份、胸腹水48份、尿液14份、脑脊液13份、脓液7份；经MTB培养结果鉴定，阳性252份、阴性386份。本研究经医院伦理委员会批准，受试者或其监护人均签署知情同意书。

1.2 MTB快速检测方法 所有标本同时行抗酸涂片镜检及Xpert检测，均在二级生物安全柜内完成。采用美国Cepheid公司Xpert检测系统和检测试剂盒，按其操作规程进行检测；抗酸涂片染色采用珠海贝索生物技术有限公司生产的抗酸染色液试剂盒，按照《痰涂片镜检与标准化操作及质量保证手册》中的操作规程进行检测，用Olympus光学显微镜镜检。联合检测用平行试验（并联试验），凡有一项指标阳性即判为阳性，全部结果均阴性才为阴性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。以MTB培养结果为参考，评价Xpert、抗酸涂片镜检单独与联合的诊断价值；计数资料以百分比表示，数据比较行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义；分析三种方法与MTB培养结果诊断的一致性，Kappa≥0.75表示一致性较好、0.4～＜0.75表示一致性一般、＜0.4表示一致性较差。

2 结果

2.1 Xpert检测与抗酸涂片镜检结果 Xpert检测阳性245份（MTB培养阳性232份、阴性13份），阴性393份（MTB培养阳性20份、阴性373份）；抗酸涂片镜检阳性86份（MTB培养阳性62份、阴性24份），阴性552份（MTB培养阳性190份、阴性362份）。

2.2 Xpert检测、抗酸涂片镜检单独与联合检测诊断效能比较 Xpert检测、抗酸涂片镜检与Xpert联合检测的灵敏度、准确度、阳性预测值、阴性预测值均高于抗酸涂片单独检测（P均＜0.05），联合检测与Xpert单独检测差异均无统计学意义。Xpert检测、抗酸涂片镜检单独与联合检测的约登指数分别为88.7、18.4、91.3，与 MTB培养结果诊断的一致性Kappa分别为0.891、0.208、0.909，联合检测的约登指数、Kappa值均高于单独检测。见表1。

表1 Xpert检测、抗酸涂片镜检单独与联合检测对结核病的诊断效能

3 讨论

结核病作为我国重大传染病之一，一直危害着人类的健康。近年来，我国新发的耐药肺结核每年约12万例，与普通肺结核相比，耐药结核病传染性高、治愈率低、治疗时间长，给结核病的防控工作带来新的挑战［2］。一线抗结核药物治疗中，利福平耐药是治疗失败的主要原因，且MTB极易对利福平耐药，一旦出现利福平耐药会给临床治疗带来困难［5］。因此，快速准确诊断结核病，对降低结核病病死率，改善患者预后，节约医疗资源，降低传播风险至关重要。

目前临床诊断结核病主要依靠实验室检查，包括传统的抗酸涂片镜检和细菌培养及药敏鉴定实验。抗酸涂片镜检对菌量要求高，灵敏度低，要求菌量达（5～10）×103/mL才能检出，因此涂片镜检阳性检出率仅30%左右，尤其是脑脊液、胸腹水等无菌标本更易漏诊；而且，该方法不能区分MTB和NTM，尤其近几年来NTM比例有上升趋势，因此该法对结核病的诊断会造成一定困扰；另外，该法不能区分死菌和活菌，不利于疾病的治疗及预后判断。MTB培养及药敏鉴定耗时较长（传统的罗氏培养和比例法药敏需要8周，MGIT液体培养和药敏试验至少需要5周），对送检样本的时间、容器等质量要求较高，且必须是活菌，操作繁琐，对生物安全要求较高。因此，以上两种方法均不能满足临床快速诊断的需求，寻找一种高灵敏度和高特异度的检测方法迫在眉睫［6］。

Xpert检测技术是近年新兴的分子诊断方法，其采用全自动荧光定量PCR技术，将约2 mL检测标本置入试剂盒中，样品自动前处理释放出MTB DNA，自动扩增检测，实现了真正的封闭系统，样品盒和仪器之间不存在湿式接触，扩增和检测同时进行，适用于多种类型的标本检测，且消除了污染。该技术通过对MTB特有的rpo B基因作为靶基因设计引物和探针（探针A、B、C、D、E）以获得检测结果，具有较高的灵敏度和特异度。由于95%利福平耐药菌株均由rpo B基因突变（81 bp的核心区域RRDR）造成，因此该方法可在2 h内完成对MTB和利福平的耐药性测定［7-9］。本研究共252例患者确诊结核病，Xpert检测的灵敏度为92.1%、特异度为96.6%、准确度为94.8%，均明显高于抗酸涂片镜检，且与MTB培养具有较高的一致性，与国内报道的灵敏度和特异度较接近。这说明Xpert检测技术可以帮助临床精准快速诊断结核病，减少一定的误诊率和漏诊率［9-10］。

Xpert检测技术作为一个独立的PCR检测系统，对实验室生物安全和环境要求相对较低，对生物安全防护级别要求与抗酸涂片镜检相当，对实验人员要求也较低［11］。本研究将这两种快速检测方法进行了联合检测，结果显示联合检测的灵敏度、准确度和约登指数较抗酸涂片单独检测明显提高，较Xpert单独检测有所提高但差异不显著。分析其原因可能是Xpert自身已经具有较高的灵敏度和特异度，理想状态的灵敏度和特异度是100%，而Xpert已经达到92.1%和96.6%，可提升的空间已经很小，所以联合检测并没有显示出明显的优势，同时也证明了Xpert确实是一种快速准确诊断结核病的较好方法。另外，本研究仅对252例结核病患者进行了初步研究，确切的结论有待于后续多中心、大样本量的统计分析。由于Xpert对MTB有特异性，对NTM无特异性，因此联合检测时抗酸涂片镜检阳性同时Xpert阴性者，理论上高度怀疑NTM感染，同时Xpert阳性基本可排除NTM感染［12］。有报道显示，抗酸涂片镜检阳性Xpert阴性与培养诊断NTM有较高的一致性，可早期筛检出90%以上的NTM患者，提高了诊断的时效性［13］。因此，联合检测对辅助诊断NTM具有一定意义。

Xpert作为一个高灵敏度、高特异度的分子诊断技术，在早期诊断结核病的领域将越走越广，已经被应用到诊断各类结核病中，常联合超声、CT、病理等方法诊断骨结核、肠结核、胸膜结核等。另外，有研究报道Xpert对利福平的耐药也能快速检测出来，优于传统的方法，因此Xpert在检测利福平耐药方面的临床价值更高［14］。同时《儿童结核病管理指南》推荐Xpert用于诊断儿童结核病，针对儿童疑似结核病、耐多药结核病以及儿童结核性脑膜炎脑脊液的检测，Xpert可先于传统方法（涂片、培养）作为初筛实验使用［15］。

综上所述，Xpert诊断结核病具有较高的灵敏度和特异度，明显优于单独抗酸涂片镜检；Xpert联合抗酸涂片检测没有明显提高Xpert的诊断效能，但对NTM辅助诊断可能具有一定意义。