基于网络药理学预测桔梗治疗支气管哮喘的作用机制

莫蕊辰，王娓娓，赵磊，牟林茂

1山东中医药大学，济南250000；2山东省立医院

支气管哮喘是最常见的气道慢性炎症性疾病之一，患者发作时可出现广泛多变的可逆性气流受限，伴随反复发作性的喘息、气促、胸闷或咳嗽，若诊治不及时可产生不可逆性气道狭窄和气道重塑，急性发作甚至危及生命。目前西医对支气管哮喘的主要治疗模式为阶梯治疗方案，根据患者的病情严重程度和控制水平选择相应的治疗级别。但该方案中激素的应用对部分患者病情控制效果不佳，且长期应用激素不良反应大，容易产生依赖。中医治疗支气管哮喘有完整的辨证论治体系与用药规律，并具有一定优势，可以提高支气管哮喘患者第1秒通气量和用力肺活量［1］。桔梗是经典的止咳、平喘类药物，能有效改善和预防支气管症状。但目前研究多集中于对桔梗单体成分作用机制的研究，尚未明确桔梗治疗支气管哮喘的靶点及具体通路。2019年11月—2020年10月，本研究运用网络药理学方法挖掘桔梗与支气管哮喘的相关靶点及通路，探讨桔梗治疗支气管哮喘潜在的作用机制，以期为支气管哮喘中医药临床用药提供有价值的理论参考。

1 材料与方法

1.1 桔梗化学成分收集和筛选 在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）查询桔梗，获得桔梗的有效成分。以口服生物利用度（OB）≥10%、化合物类药性（DL）≥0.18对桔梗有效成分进行筛选，得到符合条件的化学成分。

1.2 桔梗成分作用靶点收集及可视化网络图构建 在有机小分子生物活性数据库（Pubchem）中输入筛选后的桔梗有效成分，得到化学成分的部分靶点、表示化学成分结构的Canonical SMILES序列及化学成分的2D/3D结构，剔除既没有靶点也没有序列的成分，即得到桔梗的最终有效成分；将得到的部分靶点以人类物种（编号9606）和活性（active）进行进一步筛选。将Pubchem获得的Canonical SMILES序列输入Swiss target prediction数据库进行搜索，以Probability≥0.1为筛选条件，得到部分桔梗靶点。将两个数据库中获得的靶点合并，以uniport ID为标准去重复得到桔梗的最终靶点。将最终靶点导入Cytoscape 3.6.2软件制作有效成分与相关作用靶点的关系网络图，利用软件的Tools模块，得到“桔梗—有效成分—作用靶点”网络参数。其中一个靶点Degree值代表了与该靶点直接发生作用的靶点数目，靶点的Degree值越大，说明该靶点的生物功能越多，其生物学重要性越强。设定Degree值≥3，得到桔梗中发挥相对重要作用的成分及靶点并对其进行可视化处理。

1.3 支气管哮喘靶点收集和筛选 将asthma分别输入治疗靶点数据库（TTD）、Drugbank数据库、疾病基因综合数据库（DisGeNET）、毒性与基因比较数据库（CTD）、genecards数据库、在线孟德尔人类遗传数据库（OMIM）、GAD数据库、京都基因和基因组合百科全书（KEGG）获得各数据库的支气管哮喘靶点。将以上数据库所得结果合并、去重复，获得支气管哮喘的已知靶点，检索时限为2019年12月25日。由于数据库繁杂，不同数据库中获得的基因难以对应，故利用Uniport数据库进行蛋白—基因名标准化，将蛋白名转化为基因名。

1.4 桔梗治疗支气管哮喘靶点蛋白质相互作用（PPI）网络构建 将桔梗靶点与支气管哮喘靶点取交集、去重复，得到桔梗治疗支气管哮喘的预测靶点。将预测靶点导入STRING数据库，物种设定为Homo snpiens，获得桔梗治疗支气管哮喘靶点的PPI网络。将获取到的结果导入Cytoscape3.6.2软件中，进行PPI网络可视化处理，其中网络节点即靶点、边的信息即蛋白质相互作用关系，节点大小根据Degree值确定，Degree值越大，节点越大。

1.5 PPI网络拓扑分析与核心靶点获取 在Cytoscape3.6.2软件中利用Tools模块中的Network Analyzer插件，对桔梗治疗支气管哮喘靶点的PPI网络进行分析，可得到自由度、介数、接近中心性、平均最短路径长度等拓扑相关参数。利用apps模块中的cytoHubba插件对PPI网络进行核心靶点拓扑，得到桔梗映射到支气管哮喘上的核心靶点网络图，其中越关键的靶点颜色越红。

1.6 核心靶点的GO功能富集与KEGG通路分析通过DAVID数据库将获取的核心靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路分析，以P＜0.05为筛选标准进行升序排列，取排名前10的结果对桔梗治疗支气管哮喘的作用机制进行预测。

2 结果

2.1 桔梗有效成分获取结果 在TCMSP中共查询到桔梗有效成分130种，其中符合OB≥10%的成分52种、符合DL≥0.18的成分37种、符合OB≥10%且DL≥0.18的成分22种，符合筛选规则的22种成分包括刺槐素、木犀草素、桔梗皂苷元等。见表1。

2.2 桔梗成分靶点及可视化网络图 在Pubchem中分别输入筛选后的22个有效成分，其中5个成分有靶点，12个成分有Canonical SMILES序列，10个成分既没有靶点也没有序列，得到最终有效成分12个。Pubchem中共获得3 680个靶点，经筛选获得212个靶点；Swiss target prediction数据库中共获得1 100个靶点，经筛选获得590个靶点，两个数据库靶点合并、去重后共得到311个最终靶点。桔梗中发挥相对重要作用的成分为刺槐素、木犀草素、桔梗皂苷元、桔梗酸C等；发挥相对重要作用的靶点分别为 AKR1B10、CYP1B1、CYP1A1、NFKB1、POLB、ALOX5等。桔梗—有效成分—作用靶点可视化网络图见OSID码图1。

表1 桔梗有效成分

2.3 支气管哮喘靶点获取结果 将各个数据库的结果合并、去重复后，共得到1 551个支气管哮喘靶点。

2.4 桔梗治疗支气管哮喘靶点PPI网络构建结果将311个桔梗成分靶点与1 551个支气管哮喘靶点合并、取交集、去重，共得到137个桔梗治疗支气管哮喘靶点。通过STRING数据库得到桔梗治疗支气管哮喘的PPI网络，此网络共包括137个节点，1 292个边。桔梗治疗支气管哮喘靶点的PPI网络图见OSID码图2。

2.5 桔梗治疗支气管哮喘核心靶点获取结果 共筛选出10个桔梗治疗支气管哮喘的核心靶点，包括半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体α（ESR1）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、雄性激素受体（AR）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、MMP2、诱导髓系白血病细胞分化蛋白（MCL1）。桔梗治疗支气管哮喘核心靶点网络图见OSID码图3。

2.6 核心靶点的GO功能富集与KEGG通路分析结果 GO功能富集分析共得到GO条目77个，其中生物过程53个、分子功能13个、细胞组成11个，前10的结果中包含生物过程8个（分别为一氧化氮生物合成过程的正调控、蛋白磷酸化正调控、胚胎植入、平滑肌细胞增殖的阳性调节、细胞对机械刺激的反应、伤口愈合、对雌二醇的反应、凋亡过程的负调控）、分子功能1个（核相关分子功能）、细胞组成1个（酶的绑定）。KEGG通路分析共得到KEGG通路35条，其中前10的通路依次为癌症中的蛋白聚糖、癌症通路、雌激素信号通路、酪氨酸激酶受体家族信号通路、低氧诱导因子1信号通路、磷脂酰三磷酸肌醇—丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信号通路、丝裂原激活的蛋白激酶信号通路、非小细胞癌、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路、血管内皮生长因子信号通路。

3 讨论

本研究运用网络药理学方法预测桔梗治疗支气管哮喘的作用机制，共筛选获得桔梗治疗支气管哮喘的有效靶点137个，核心靶点10个，GO条目78个，KEGG通路35条。提示桔梗通过一氧化氮生物合成过程的正调控、蛋白磷酸化正调控、平滑肌细胞增殖的阳性调节等生物过程，以及ErbB、mTOR、HIF-1等信号通路来发挥对支气管哮喘的治疗作用

本研究对桔梗—有效成分—作用靶点的分析显示，桔梗中的刺槐素、木犀草素可能是治疗支气管哮喘的关键成分。刺槐素是从刺槐中提取的一种黄酮类化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎的功能，并且可以通过抑制巨噬细胞上TRAIL-R1死亡受体的表达水平来介导细胞凋亡［2］。陈菲菲等［3］认为，刺槐素可能通过抑制维甲酸受体相关孤儿受体γt活化，减少CD4+CD62L+T细胞向Th17细胞分化及IL-17的表达，从而降低中性粒细胞炎症反应，起到治疗支气管哮喘的作用。LI等［4］研究显示，刺槐素可通过降低支气管肺泡灌洗液中炎症因子INF-α和IL-2的水平来减轻肺组织病理损伤。木犀草素是从木犀草属中提取的一种黄酮类化合物，分布较广泛，具有抗肿瘤、抗炎、抗心肌缺血、调节免疫应答等药理作用。余洁等［5］研究显示，木犀草素可以抑制支气管哮喘患儿外周血单核细胞促炎细胞因子TNF-α、IL-6的分泌，其可能通过作用于TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎效应，对支气管哮喘具有潜在的治疗作用。赵长祺等［6］的实验显示，一定浓度（2.5、5、10 mg/L）的木犀草素能够抑制T淋巴细胞增殖，并诱导T淋巴细胞凋亡，其中10 mg/L木犀草素可能通过下调T淋巴细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、上调促凋亡蛋白Bax的表达来影响线粒体凋亡通路。缪存静等［7］认为，木犀草素可以通过下调标志蛋白E-钙黏素表达，上调波形蛋白表达来逆转转化生长因子β1诱导的肺癌A549细胞的上皮—间充质转化，同时对肺癌细胞的侵袭和转移有一定的抑制作用。由上可见，桔梗中的刺槐素、木犀草素等有效成分，表现出抗炎、抗肿瘤、调节免疫应答等作用，可能做为关键成分参与到支气管哮喘的治疗中。

本 研 究 结 果 显 示 ，CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9、MMP2等10个核心靶点在桔梗治疗支气管哮喘中发挥了重要作用。气道炎症、气道重塑目前被认为是支气管哮喘本质的病理机制，其中炎症介质以及细胞凋亡的参与十分重要，而CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9都是参与上述变化的典型因子。CASP3是细胞凋亡的关键一环，当细胞线粒体膜损伤，线粒体内的细胞色素释放到细胞外，可激活CASP3从而诱导细胞凋亡。同时，CASP3还可通过内质网通路发挥调控细胞凋亡的作用，参与支气管哮 喘 气 道 重 塑 的 过 程［8］。VALLESE 等［9］发 现 ，MAPK3的亚型p38 MAPK在支气管哮喘患者气道黏膜下层高度表达，对体外支气管上皮细胞刺激后，p38 MAPK mRNA升高。其引起气道炎症的机制为气道上皮细胞被刺激后，p38 MAPK活化，可导致炎症介质IL-8、TNF-α等释放；p38 MAPK还参与上呼吸道病毒感染引起的炎症反应，在支气管哮喘急性加重期起重要作用［10］。研究显示，p38 MAPK与线粒体细胞凋亡途径有关，抑制其活化可能减少气道平滑肌细胞增生，抑制气道重塑［11］。桔梗可能作为p38 MAPK抑制剂，通过抑制其活化减少炎症因子的分泌，对气道炎症发挥作用。此外，EGFR及其配体表达于气道上皮，调节气道上皮修复，参与气道重塑与气道黏液高分泌。李晓辉等［12］研究结果显示，EGFR抑制剂可能通过下调EGFR的表达、抑制依赖于EGFR下游的细胞信号转导级联反应来缓解支气管哮喘气道重塑过程。张沄等［13］发现，许多刺激黏液产生的刺激物通过增加细胞膜表面MMPs来裂解和活化EGFR的上游受体，而EGFR的表达与气道黏液杯状细胞病理性增生存在正相关性，因此抑制EGFR的表达可以减少黏液高分泌导致的气道受阻。在MMPs家族中，MMP9是诱导气道重塑的重要因子，MMP9与其抑制物TIMP1的失衡会导致细胞外基质降解，降解产物在黏膜下层堆积会导致气道壁增厚，加速气道重塑过程［14-15］。由上可见，导致气道炎症、气道重塑的CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9等因子，通过诱导细胞凋亡、介导炎症介质释放、增加气道黏液高分泌等过程推动了气道炎症反应，影响并加速气道重塑，且上述因子不仅存在多途径、多通路介导同一病理变化的情况，还存在相互介导、协调的关系，构成了复杂的关系网络。

GO功能富集分析结果显示，桔梗治疗支气管哮喘主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控、蛋白磷酸化正调控、平滑肌细胞增殖的阳性调节、细胞对机械刺激的反应、凋亡过程的负调控等多个环节。KEGG通路富集结果显示，ErbB信号通路、mTOR信号通路、HIF-1信号通路、VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等可能是桔梗治疗支气管哮喘的关键通路。ErbB存在多种配体与靶基因，ErbB信号通路通过EGFR等受体与表皮细胞生长因子、双向调节蛋白等配体相结合后，激活MAPK等下游相关基因来调控细胞增殖等活动，而细胞增殖贯穿支气管哮喘气道重塑过程的始终。HIF-1是一种氧依赖性转录激活因子，主要在缺氧条件下表达。文献表明，HIF-1信号通路与其他信号通路间存在交叉调节，同时也是多条信号通路的必经环节。王莉等［16］发现，mTOR、4EBP1、HIF-1、VEGF信号通路在支气管哮喘的发生发展中发挥重要协同作用。上游mTOR信号通路被激活后，HIF-1表达上调，作为HIF-1的下游因子VEGF表达随之上调，其信号通路也被激活，这一过程使得嗜酸性粒细胞等多种炎症细胞聚集、浸润于气道，引起气道高反应的同时损伤气道上皮细胞，且在炎症刺激下气道壁血管通透性增加，气道壁组织充血水肿，气道变窄，从而加速支气管哮喘的进展。此外，与细胞增殖、凋亡及气道重塑有关的PI3K-Akt和MAPK因子在缺氧的条件下，也可成为HIF-1信号通路的上游，激活HIF-1信号通路［17］。

综上所述，本研究通过网络药理学对桔梗治疗支气管哮喘的潜在作用机制进行多成分、多靶点、多通路的分析。桔梗中的有效成分可能通过调控CASP3、MAPK3、EGFR等关键靶点作用于mTOR、HIF-1、VEGF等信号通路，整体协同发挥抗炎、抑制气道重塑的作用。由于本研究未对有效成分、作用靶点、信号通路中的各环节进行权重，可能会影响网络构建的精确度，所以获得的靶点和通路还需要实验来进一步验证。