腺苷三磷酸对人外周血单个核细胞hBD-2表达的影响及其分子机制探讨

张梦洁

上海中医药大学附属普陀医院，上海200062

人β防御素2（hBD-2）是第一个被发现的具有 可诱导表达特性的防御素［1］，广泛分布于皮肤、支气管肺部、子宫等部位，尤其以支气管肺部表达最多。其具有良好的杀菌能力和抗病毒、抗真菌、抗肿瘤等多种生物学活性，能趋化多数免疫细胞，在固有免疫和特异性免疫中均有重要功能，因此在肺部炎症性疾病中发挥重要作用。在自然条件下，hBD-2表达水平极低或不表达；在受到外界因素刺激诱导后，则在各种组织黏膜细胞中表达并上调，发挥其抗微生物和调节免疫的功能［2］。腺苷三磷酸（ATP）是一种辅酶，通过多种蛋白功能为机体多种合成反应提供所需能量，增强机体组织及细胞的代谢活性，因而其对治疗各种疾病均有较强的针对性。目前，ATP已被广泛应用于细菌、病毒、球虫等引起的呼吸、消化及生殖系统疾病的临床辅助治疗。实验研究发现，ATP可以上调大鼠防御素2（mBD-2）的表达，但ATP是否可以上调hBD-2的表达水平目前鲜有文献报告。2016年9月—2017年7月，我们应用ATP体外刺激人外周血单个核细胞（PBMCs），观察其是否可诱导hBD-2表达，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂 PBMCs分离液（Ficoll）及ATP干粉均购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国BI公司，青霉素链霉素溶液（双抗）、RPMI-1640培养液、HBSS和PBS缓冲液均购自美国HyClone公司，台盼兰购自美国Gibco公司，人白细胞介素1β（IL-1β）和hBD-2酶联免疫吸附（ELISA）测定试剂盒均购自武汉Elabscience公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标本来源与收集 经医院伦理委员会批准，收集健康志愿者20名，男10例、女10例，年龄（35.2±10.5）岁，汉族，均已签署知情同意书。无菌抽取健康志愿者外周血9 mL于EDTA管抗凝，2 h内进行PBMCs的分离。

1.2.2 人PBMCs的分离 采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法。用无菌吸管各取3 mL血液于3只15 mL离心管中，并各加入3 mL等量HBSS液进行1∶1稀释，轻轻上下吹打，充分混匀；用10 mL注射器吸取摇匀的Ficoll 3 mL于15 mL离心管内，避免管壁残留分离液（Ficoll∶稀释前全血∶HBSS=1∶1∶1）；将离心管倾斜45°，枪头紧贴管壁将稀释全血沿管壁缓慢加于Ficoll液面上，注意保持两者界面分层清晰。在室温（20℃）下，用水平离心机以离心半径10 cm、400 g离心30 min。离心后管内分为三层，在第一、二层交界处有一狭窄带，呈白色云雾状，以单个核细胞为主。用移液枪去除最上层，小心吸出PBMC层（1～2 mL），移至另一15 mL离心管中。加入6～8倍体积PBS洗涤2次，室温下以离心半径10 cm、400 g离心5 min，留取沉淀。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液1 mL重悬细胞，并配成单个细胞悬液。将重悬了PBMCs的RPMI-1640培养液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，显微镜下观察并计数。用移液器吸取10 μL细胞悬液到离心管中，再加入0.4%台盼蓝10 μL染液，于显微镜下计数PBMCs，活细胞百分比达95%以上，达到实验要求。

1.2.3 PBMCs分组与ATP干预 在超净台内，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基调整细胞密度为1×106/mL；将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μL；将PBMCs分为六组，每组设3个复孔。空白组不处理，0、25、50、100、200 μmol/L ATP组分别加入 HBSS液和 25、50、100、200 μmol/L ATP 100 μL，于37℃、5%CO2及相对湿度为95%的培养箱中培养。分别于培养12、24 h后终止培养，将各组培养后的细胞悬液转移至1.5 mL无菌离心管中，标记编号后以离心半径10 cm、1 500 r/min低温离心10 min，留取适量培养上清液置-80℃冰箱内保存。

1.2.4 PBMCs培养上清液hBD-2、IL-1β检测 收集培养上清液，以离心半径10 cm、3 000 r/min离心5 min，取上清液，采用双抗体夹心ELISA法检测hBD-2和IL-1β，具体步骤按试剂盒要求。即加50 μL待测样品及系列浓度的标准溶液在细胞因子单抗包被的酶标板上，室温孵育使细胞因子结合到酶标板上，再加入二抗孵育结合；最后加底物液显色30 min，用酶标仪在450 nm波长处测OD值并计算hBD-2和IL-1β含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。所有计量数据以-x±s表示，多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较行LSD-t检验，组内不同时间点的比较行重复测量方差分析，相关关系采用Person相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PBMCs培养上清液中hBD-2水平比较 见表1。

2.2 各组PBMCs培养上清液中IL-1β水平比较 见表2。

2.3 ATP作用后PBMCs培养上清液中hBD-2与IL-1β水平的关系 经ATP作用12、24 h时，PBMCs培养上清液中hBD-2与IL-1β水平均呈正相关（r分别为0.494、0.725，P均＜0.01）。

3 讨论

hBD-2是防御素家族中非常重要的成员，主要表达于皮肤、支气管等各种黏膜上皮细胞，外周血中的中性粒细胞和单核细胞在致炎因子刺激下也可以表达 hBD-2［3-4］。在高浓度时，hBD-2 对病原微生物具有直接杀伤作用；而低浓度时，hBD-2就只有趋化性，它可趋化募集树突状细胞、T淋巴细胞、白细胞、肥大细胞和巨噬细胞等，使这些细胞聚集在感染部位、诱导分化成熟、促进细胞因子产生；而这些细胞及细胞因子反过来又影响hBD-2的诱导表达，从而对机体的免疫状态产生影响。hBD-2也可通过激活G蛋白偶联受体和磷脂酶C途径还能与肥大细胞表面两种特异性受体结合，从而诱导肥大细胞聚集到炎症部位并活化、脱颗粒、释放组胺，参与速发型超敏反应［5］。研究显示，hBD-2是Toll样受体（TLR）的内源性配体，通过TLR2、TLR4、CC趋化因子受体6（CCR6）等受体介导，在IL-1相关蛋白激酶（IRAK）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）等信号转导分子的协同作用下，触发细胞内信号级联反应，激活NF-κB，活化T淋巴细胞，触发强有力的特异性免疫应答［6］。YANG等［7］发现，hBD通过CCR6途径诱导的未成熟树突状细胞（iDC）的迁移，在hBD-2的刺激下通过CCR6促进iDC迁移，促进抗原提呈作用，激活T细胞，引发免疫应答。

表1 各组PBMCs培养上清液中hBD-2水平比较（）

表1 各组PBMCs培养上清液中hBD-2水平比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与0 μmol/L ATP组比较，bP＜0.01；与 25 μmol/L ATP组比较，cP＜0.01；与 50 μmol/L ATP组比较，dP＜0.01；与同组培养12 h比较，eP＜0.01。

images/BZ_15_234_402_1193_520.png99.57± 9.03 117.71± 8.07abe 133.79± 8.69abce 114.87±12.73abce 150.40±10.02abcde 99.82± 9.57 0 μmol/L ATP组25 μmol/L ATP组50 μmol/L ATP组100 μmol/L ATP组200 μmol/L ATP组空白组93.17± 5.67 106.62± 8.85ab 113.31± 7.98ab 120.97±10.30abc 128.39±10.48abcd 93.97± 7.92

表2 各组PBMCs培养上清液中IL-1β水平比较（）

表2 各组PBMCs培养上清液中IL-1β水平比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与0 μmol/L ATP组比较，bP＜0.01；与 25 μmol/L ATP组比较，cP＜0.01；与 50 μmol/L ATP组比较，dP＜0.01；与100 μmol/L ATP组比较，eP＜0.01；与同组培养12 h比较，fP＜0.01。

24 h 14.08±2.50 17.34±2.29abf 19.93±3.69abf 24.32±4.42abcdf 27.41±4.06abcdef 13.00±2.05组别0 μmol/L ATP组25 μmol/L ATP组50 μmol/L ATP组100 μmol/L ATP组200 μmol/L ATP组空白组IL-1β 12 h 10.92±2.43 12.61±4.60 14.30±4.08ab 17.35±2.76abc 18.83±3.38abcd 10.66±2.75

有研究发现，ATP还具有细胞间信息传递功能［8］，可提高细胞内钙离子水平，促进钙离子参与调节细胞的多种生物学功能。钙非特异性调节剂ATP能通过与特殊受体（P2-嘌呤受体）结合，促进磷酸肌醇激酶的水解，从而引起钙动员、胞内钙升高，导致细胞的特殊反应；这些反应依据细胞类型不同而异，并且与细胞的功能有关［9］。hBD-2在自然条件下表达水平极低或不表达，当受到刺激诱导后则在各种组织黏膜细胞中表达并上调，发挥其抗微生物和调节免疫的功能［2］。hBD-2的可诱导表达特性，为利用某种人工方式调控其表达提供了理论依据。PBMCs为免疫活性细胞的集合体，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞等免疫活性细胞，尤其T淋巴细胞，在机体免疫反应中扮演重要作用。hBD-2能趋化多数免疫细胞，因而在固有免疫和特异性免疫中均起着重要作用。

为探索人工促进hBD-2表达上调的方法，以进行体内研究且能应用于临床，并进一步探讨hBD-2与机体免疫状态的关系。本研究先提取人PBMCs，用培养基调节至一定浓度后接种于培养板中，分别加入不同浓度的ATP液于培养箱中培养，分别于12、24 h收集细胞培养上清液，用ELISA法检测其上清中的hBD-2及IL-1β。结果发现，与空白组和0 μmol/L ATP组比较，经不同浓度ATP组处理后，PBMCs细胞培养上清中hBD-2及IL-1β表达水平出现不同程度的上调，差异有统计学意义；且随着ATP浓度适当的增加及作用时间的延长，细胞培养上清液中hBD-2及IL-1β的表达水平可进一步升高。本研究结果进一步证明了ATP可以诱导人体内hBD-2和IL-1β表达，并可通过人体免疫细胞发挥作用，在增强机体免疫方面起极为重要的作用。本研究结果提示，经ATP处理后，PBMCs培养上清液中hBD-2与IL-1β的表达水平呈正相关，这与SUN等［10］发现大鼠肺组织中mBD-2与IL-1β表达呈正相关这一观点相符。目前的研究表明，hBD-2的诱导表达可能是通过多种信号途径实现的，核转录因子κB（NF-κB）信号通路被外来刺激信号激活可能是hBD-2基因激活的机制之一，hBD-2的表达是通过激活NF-κB、在IL-1β及TNF-α参与下实现的［11］。也有研究表明，ATP是促进巨噬细胞中IL-1β成熟与分泌的重要内源性刺激物［12-13］。结合本研究可以推测，ATP作用于PBMCs后使细胞内钙离子浓度增高，导致NF-κB信号通路激活，从而诱导细胞因子如IL-1β和hBD-2表达，使细胞内IL-1β和hBD-2的分泌增加；而hBD-2反过来趋化免疫细胞，促进产生细胞因子如IL-1β，这些细胞因子反过来又影响hBD-2的诱导表达，两者相互影响；但ATP也有可能通过直接刺激PBMCs分泌IL-1β，进而介导hBD-2的表达上调。当然，激活hBD-2基因表达还存在其他机制，如IL-6、JAK/STAT途径等。有研究认为，其他部位的上皮细胞诱导hBD-2表达的信号转导机制与气道上皮细胞可能不同［14-15］。例如 KRISANAPRAKORNKIT 等［16］发现，通过丝裂原素活化蛋白激酶通路可以实现齿龈上皮细胞hBD-2的表达，而不是NF-κB激活通路。MOON等［17］用前炎症细胞因子IL-1α刺激中耳上皮细胞表达hBD-2，发现这是通过Raf-MEK1/2-ERK依赖性信号通路发生的；但MCDERMOTT等［18］在角膜上皮细胞用IL-1β刺激hBD-2的表达时，发现此过程既有NF-κB信号通路，也有丝裂原蛋白激酶信号通路。由此可见，各种刺激因素对hBD-2的诱导表达可能是通过多种信号途径实现的。ATP刺激PBMCs诱导hBD-2表达的具体机制和途径，尚需进一步研究。ATP作为临床常用药物，每日使用剂量可达100～200 mg。本研究提示，25 μmol/L ATP即可诱导hBD-2表达上调，这与临床上ATP使用剂量相比是极其微量的，这为肺部感染患者临床上使用小剂量ATP来诱导机体hBD-2的表达并辅助抗感染提供了依据。