GDF11对糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞细胞凋亡的影响及其信号机制

翟 羽，吴方丽，田萧羽，李 爽，郭树琴，朱 彪，赵立升，郭红延

随着我国经济的高速发展、生活方式西方化和人口老龄化，2型糖尿病患病率和发病率急剧上升[1]。2型糖尿病是口腔种植术的相对禁忌证，其中一个重要原因就是高血糖所致的晚期糖基化终末产物聚集导致骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)凋亡[2]。文献[3]报道，生长分化因子11(growth differentiation factor 11, GDF11)能缓解2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗，改善胰腺β细胞功能并减少β细胞凋亡[4]。而且，GDF11对2型糖尿病小鼠的这些有益作用是通过激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信号通路实现的[3-5]。但是，GDF11对2型糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡的影响及相关信号机制尚不清楚。因此，本课题以体外培养的2型糖尿病小鼠BMSCs为研究对象，探讨GDF11对2型糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡的影响及其信号机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器 正常小鼠与糖尿病小鼠BMSCs(解放军总医院转化医学中心实验室)，重组人GDF11蛋白(北京百奥莱博)，PI3K特异性抑制剂LY294002(美国Selleck)，α-MEM培养液、胎牛血清(美国Gibco)，胰酶、台盼蓝、青霉素及链霉素(美国Sigma)，兔抗人PI3K抗体、磷酸化PI3K(p-PI3K)抗体、兔抗鼠Akt抗体、p-Akt抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体及山羊抗兔二抗(美国Cell Signaling Technology)；BCA(bicinchoninic acid)测定试剂盒(武汉博士德)；PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美国Millipore)。

Herocell C1型CO2恒温培养箱(中国润度生物)；BCM-1000A型生物净化工作台(苏州安泰)；5702R型低速离心机、Biophotometer核酸蛋白测定仪(德国eppendorf)；DYY-7C型电泳仪、DYCZ-40型转膜仪(北京六一仪器厂)；LW300LFT型正置荧光显微镜(日本奥林巴斯)。

1.2 细胞分组 实验分组：正常小鼠BMSCs组(normal; Nor)，糖尿病小鼠BMSCs组(diabetes; DB)，GDF11干预组(DB+GDF11; GDF11)和PI3K/Akt信号通路抑制剂组(DB+GDF11+LY294002；LY)。复苏细胞库冻存的BMSCs，采用含10%胎牛血清的α-MEM培养液培养1 d后，全换液。加药后继续培养3 d进行后续实验，加药顺序：加入50 μM的LY294002[6]培养30 min后，加入30 g/ml GDF11[7](未标明加药的组别不处理)。

1.3 细胞凋亡率 取各组细胞，0.5%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液。然后，采用浓度为0.4%的台盼蓝染液进行染色。9滴单细胞悬液加1滴台盼蓝染液混匀后铺板，细胞计数仪检测各组细胞的凋亡率。细胞凋亡率(%)=着色细胞/总细胞×100%。

1.4 Western blot检测相关蛋白的表达 取各组细胞，PBS缓冲液冲洗3遍，然后加入细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白。测定总蛋白浓度后，各取50 μg总蛋白，上样后进行凝胶电泳。电泳后在220 mA, 2 h的条件下转膜于0.2 μm的PVDF膜，室温封闭2 h，分别滴加特异性一抗封闭过夜，再以辣根过氧化物酶标记的二抗封闭2 h。最后，用化学发光剂染色、显影并采用Image J软件分析胶片灰度。所有实验至少重复3次。

2 结 果

2.1 GDF11对糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡率的影响 与正常小鼠BMSCs[(3.1±1.1)%]相比，糖尿病小鼠细胞BMSCs(DB组)凋亡率明显升高[(36.2±3.3)%，P<0.05]，而GDF11干预(GDF11组)显著降低(18.9±1.9)%vs.(36.2±3.3)%，P<0.05]。当加入PI3K特异性抑制剂LY294002后(LY组)，GDF11降低凋亡率的作用显著升高[(41.1±3.9)%vs.(18.9±1.9)%，P<0.05]。

2.2 GDF11对糖尿病小鼠BMSCs凋亡相关蛋白表达的影响 如图1与表1所示，与正常小鼠BMSCs(Nor组)相比，糖尿病小鼠细胞BMSCs(DB组)抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的表达比(Bcl-2/Bax)明显降低，而GDF11干预(GDF11组)显著升高Bcl-2/Bax蛋白表达比。当加入PI3K特异性抑制剂LY294002后(LY组)，GDF11升高Bcl-2/Bax的作用显著降低。

图1 各组细胞凋亡相关蛋白的表达

表1 各组细胞凋亡蛋白相对表达量

2.3 GDF11对PI3K/Akt信号通路的影响 与Nor组相比，糖尿病小鼠BMSCs细胞(DB组)p-PI3K和p-Akt的表达水平均显著降低，而GDF11干预(GDF11组)显著升高p-PI3K和p-Akt的表达水平，激活PI3K/Akt信号通路。而且，GDF11激活PI3K/Akt信号通路的作用可被LY294002阻断(LY组)，p-PI3K和p-Akt的表达水平均显著降低(图2与表2)。

图2 GDF11对PI3K/Akt信号通路的影响

表2 各组细胞PI3K和Akt的磷酸化水平

3 讨 论

本研究以糖尿病小鼠BMSCs为研究对象，发现GDF11能降低糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡率，降低促凋亡蛋白Bax的表达并提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并且GDF11的这些作用与激活PI3K/Akt信号通路有关。

细胞凋亡是在特定的信号诱导下，细胞内级联反应被触发所致的生理性或病理性的主动死亡过程[8]。线粒体在内源性细胞凋亡调控中居于重要地位，许多Bcl-2家族成员如Bcl-2、Bax等都定位于线粒体膜上[9]。Bcl-2通过阻止细胞色素C从线粒体释放来抑制凋亡；而Bax通过与线粒体上的膜通道结合促使细胞色素C的释放来促进凋亡[10]。由于Bcl-2能防止或延迟由γ射线、糖皮质激素、热休克和多种化疗药物所致的细胞凋亡，因此Bcl-2蛋白也被称作“存活蛋白”[11]，而Bax是“凋亡蛋白”。本研究发现GDF11既能促进糖尿病小鼠BMSCs细胞Bcl-2蛋白的表达又能降低Bax蛋白的表达，即升高Bcl-2与Bax蛋白的表达比例，从而发挥抑制糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡的作用。

PI3K/Akt信号通路在细胞生长、增殖、代谢、凋亡和迁移等多种生物过程中发挥重要作用[12-14]。文献[15]报道称，激活PI3K/Akt信号通路能通过减少促凋亡蛋白caspase 3、caspase 9、Bax和升高抗凋亡蛋白Bcl-2减缓细胞凋亡。本研究发现，GDF11不仅能提高糖尿病小鼠BMSCs细胞Bcl-2与Bax蛋白的表达比例，而且能激活PI3K/Akt信号通路。最重要的是，当加入PI3K特异性抑制剂LY294002后，GDF11升高Bcl-2与Bax蛋白的表达比例的作用明显减弱，而且细胞凋亡也显著上升，这从反面证实GDF11降低糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡的作用至少在某种程度上与激活PI3K/Akt信号通路有关。如果同时使用Akt抑制检测GDF11对糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡的影响，可以更完整地证明PI3K/Akt信号通路的重要作用，这是本文的一个局限。与我们的研究相似，文献[16]报道，石斛酚抑制大鼠BMSCs细胞凋亡的作用也是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。

综上所述，本研究发现GDF11可在体外抑制糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡，并且GDF11的这种作用与激活PI3K/Akt信号通路有关。GDF11有望被开发成抑制BMSCs细胞凋亡，进而缓解糖尿病患者种植术区骨量不足的一种新型药物。