姜黄素对胸部爆震致小鼠肺组织氧化应激损伤的影响

施 琳，丛培芳，佟昌慈，柳云恩

由于恐怖事件、瓦斯等爆炸事件的增多，爆震伤成为现代战争中及非战争人员中越来越常见的创伤[1]。肺通常是原发性爆震损伤的主要部位[2]，爆震产生的冲击波会导致毛细血管-肺泡界面的破坏，导致肺泡壁破坏、实质出血等并导致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征[3]。因此，寻求可以减轻胸部爆震致肺损伤的方法，对救治伤员具有重要意义。

本课题组前期实验发现，胸部爆震可导致肺组织发生炎性反应及氧化应激损伤，并且与PI3K信号通路的激活相关。姜黄素(curcumin，CUR)是传统药物姜黄的一种成分，在印度传统医学中，它被用于治疗多种疾病。研究表明CUR具有包括免疫调节、抗氧化、抗炎和抗真菌活性在内的许多药理作用[4]。此外，还有研究发现CUR可能与一些以异常炎性反应为特征的肺部疾病有关，例如，哮喘或慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、肺纤维化和急性肺损伤[5, 6]。然而，CUR能否减轻小鼠胸部爆震引起的肺损伤则尚不清楚。本研究旨在探讨CUR对胸部爆震致小鼠肺组织氧化应激损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 30只健康雄性8周龄C57BL/6小鼠购自本溪长生生物科技有限公司，体重(21±2)g。CUR购自美国sigma公司。实验所需兔单克隆抗体MDA5、IRE-a、SOD-1、p-PI3K、PI3K、Keap1、Nrf2和GAPDH，以及山羊抗兔二抗均直接购自英国Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1 实验分组及模型建立 30只雄性小鼠随机分成对照组、模型组和模型+CUR组，每组10只。采用爆震伤装置建立小鼠胸部爆震模型。方法如下：小鼠禁食水后12 h，以碘伏消毒小鼠腹部皮肤，0.4%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉后置于爆震伤装置上，构建爆震模型。模型+CUR组于爆震前2 周开始干预。对照组和模型组小鼠腹腔注射10 mg/kg生理盐水，1次/d，连续2周；模型+CUR组小鼠腹腔注射2.5 mg/kg CUR，1次/d，连续2周。爆震后48 h麻醉并脊髓脱臼处死所有小鼠，收集肺组织标本。左肺进行10%甲醛固定并石蜡包埋切片，右肺-80 ℃保存。

1.2.2 HE染色 将切片脱蜡至水后放入苏木精(HE)中，浸泡5 min。自来水冲洗，放入1%盐酸乙醇中分化数秒。自来水流水冲洗，0.5%氨水返蓝数秒。自来水冲洗1 min，镜下控制细胞核分化程度。1%伊红水溶液染色1.5 min。切片适度自来水洗后依次浸入95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ中，每次停留1 min。浸入无水乙醇Ⅰ及无水乙醇Ⅱ中各浸泡1 min，浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min。依次取出切片，滴加适量中性树胶，盖上盖玻片，室温晾干。

1.2.3 ROS检测 冷冻切片于PBS中浸泡5 min，二氢乙啶(Dihydroethidium，DHE)10 μM避光孵育20 min，PBS中浸泡 5 min后封片，荧光显微镜镜下观察照相。在紫外光激发下，组织内未氧化的DHE发出蓝色荧光，而已氧化的DHE发出红色荧光。

1.2.4 Western blot检测 采用Western blot技术，检测肺组织氧化应激蛋白MDA5、IRE-α 和SOD-1的表达，同时检测p-PI3K、Nrf2和Keap1信号通路蛋白表达。

2 结 果

2.1 肺组织内炎性细胞浸润 HE染色结果显示，对照组小鼠肺泡排列较规则、间质未见炎性细胞浸润；模型组小鼠肺泡破裂，融合成肺大泡，肺泡间隔增厚，间质内可见明显的炎性细胞浸润。CUR处理组小鼠肺泡间隔内炎性细胞浸润明显减少(图1)。

图1 小鼠肺组织病理改变(HE，×200)

2.2 肺组织氧化应激损伤 ROS结果显示，爆震后，在紫外光激发下，小鼠肺组织红色荧光明显，表明氧化应激反应发生，而模型+CUR组的红色荧光明显减少，蓝色荧光增多，说明CUR可以改善小鼠肺组织的氧化应激反应(图2)。

图2 小鼠肺组织的氧化应激反应(×200)

2.3 肺组织氧化应激蛋白的表达 模型组与对照组相比，小鼠氧化应激蛋白MDA5和IRE-α明显升高，而SOD-1蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；模型+CUR组与模型组相比，小鼠MDA5和IRE-α蛋白表达降低，SOD-1蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05，图3，表1)。

图3 小鼠肺组织氧化应激相关蛋白表达

表1 各组小鼠肺组织氧化应激蛋白的相对表达

2.4 CUR改善模型组小鼠肺组织PI3K/Nrf2/Keap1通路蛋白表达 模型组与对照组相比，小鼠p-PI3K和Keap1蛋白表达显著增加，而Nrf2则明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；模型+CUR组与模型组相比，小鼠p-PI3K和Keap1蛋白表达显著减少，Nrf2蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05，图4，表2)。

图4 小鼠肺组织PI3K/Nrf2/Keap1通路蛋白表达

表2 各组小鼠肺组织氧化应激蛋白的相对表达

3 讨 论

肺脏是爆震伤中最常累及的器官，也是导致伤员死亡最常见的致命伤之一。而ALI更是胸部爆震后的常见损伤，ALI通常伴随炎性反应、活性氧释放、谷氨酸毒性和线粒体功能障碍等多种发病机制的参与。本研究发现，CUR处理显著降低胸部爆震引起的肺组织炎症和氧化应激反应。据报道，胸部爆震早期，肺泡壁断裂，毛细血管床减少；肺间质可见明显水肿。而PO2、TCO2、HCO3-及肺干湿重比也在ALI后明显下降，12 h达到最低。血清及肺组织促炎性因子TNF-α、IL-4和IL-6表达显著升高，而抑炎因子IL-10表达显著降低，其后，氧化应激及凋亡反应逐步发生[7]。

CUR是一种黄色色素，存在于香料姜黄中。其生物学效应的发挥是通过调节多个分子靶点，通过多种信号通路，调节多种转录因子、炎性细胞因子、酶、生长因子及受体的表达来介导的，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[8]。本研究发现胸部爆震后，小鼠肺泡间隔内的炎性反应细胞明显减少，同时ROS生成明显增多，氧化应激蛋白MDA5和IRE-a升高，抗氧化应激蛋白SOD-1降低。以上结果均说明肺组织氧化应激反应明显。在本研究中，CUR干预后的小鼠与模型组相比，肺组织内炎性反应明显降低，ROS生成减少，氧化应激蛋白MDA5、IRE-a及抗氧化应激蛋白SOD-1的变化也得到改善。

Nrf2是一种bZIP转录因子，通过调节一系列抗氧化和细胞应激基因对抗氧化应激发挥着重要作用。在正常条件下，Nrf2通过快速泛素化和蛋白酶体依赖性降解维持在较低水平。然而，在氧化应激期间其可在多个器官中被与其共定位的Keap1抑制[9]。许多研究也证实，调节PI3K/Nrf2通路可以减轻大鼠急性肾损伤和急性肺损伤，减轻胃上皮细胞氧化应激损伤，减轻脑缺血再灌注引起的神经炎性反应和氧化应激[10, 11]。本研究发现，CUR可以显著降低氧化应激蛋白表达，提高抗氧化应激蛋白表达，同时影响PI3K/Nrf2/Keap1信号通路，结果提示CUR对小鼠胸部爆震致肺损伤有保护作用，其潜在机制可能与抑制PI3K的磷酸化及激活Nrf2/Keap1信号通路相关。类似的研究发现，丹皮酚与丹参素合用通过Nrf2/HO-1和PI3K/Akt途径抑制氧化应激，减轻心肌梗死大鼠的细胞凋亡[12]。而CUR可以通过激活Nrf2来减少脂质过氧化，并维持各种抗氧化酶的活性状态，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶[13]。本研究结果提示，CUR可以显著降低胸部爆震引起的p-PI3K和Keap1的表达升高，增加爆震后降低的Nrf2的表达。

综上，CUR处理对小鼠胸部爆震致肺损伤有保护作用，其潜在机制可能与其调节PI3K/Nrf2/Keap1信号通路相关。