武警某部医院碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因分析

张 梅，谢祥红，魏文波，张 欣，邹 艳，何艳红，邓 勇

近年来，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)的检出率在全球范围内呈逐年增高趋势，给社会公共健康领域带来严重威胁[1]。自2017年以来，武警四川总队医院CRE比例明显升高。本研究其中碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)比例升高尤为突出。全国范围已有较多CRKP耐药基因的研究报道，而本院尚缺乏相关的研究资料。为了解武警四川总队医院CRKP耐药情况和耐药基因分布，收集武警四川总队医院2017-08至2020-03临床分离的CRKP，用改良碳青霉烯灭活实验(mCIM)和酶抑制剂增强试验联合检测CRKP的碳青霉烯酶表型情况，用GeneXpert对常见耐药基因进行检测，以了解我院CRKP流行情况，为临床CRKP感染治疗和医院感染防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 武警四川总队医院2017-8至2020-03临床分离的CRKP 32株，剔除同一患者重复菌株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，大肠埃希菌ATCC35218，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706，均由四川省临床检验中心馈赠。

1.2 仪器及试剂 细菌的鉴定和药敏用美国贝克曼公司Microscan.Walk Away96全自动细菌鉴定药敏分析仪。药敏折点严格按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2017版判断,头孢哌酮/舒巴坦折点按肝杆菌科头孢哌酮折点，替加环素折点按FDA标准判断。药敏纸片购自温州康泰生物科技有限公司。酶抑制剂增强试验购自上海原科实业发展有限公司。耐药基因检测采用美国塞佩公司Gene-Xpert Carba-ⅩⅤⅠR2全自动病原体快速检测系统。

1.3 mCIM试验 用1 μl接种环取血平板上过夜孵育的待测菌满环接种至2 ml TSB中，漩涡震荡10～15 s后加入一张10 μg美罗培南纸片，35 ℃孵育4 h后，用10 μl接种环取出美罗培南纸片贴于已涂布0.5麦氏浊度ATCC25922的MH平板表面，35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直径。抑菌圈直径6～15 mm或抑菌圈直径16～18 mm但抑菌圈内有针尖样菌落的为mCIM试验阳性结果；抑菌圈直径≥19 mm且抑菌圈清晰为阴性结果；抑菌圈直径16～18 mm或抑菌圈直径≥19 mm但抑菌圈内有针尖样菌落的为不确定结果。阳性结果表示检测出碳青霉烯酶；阴性结果表示未检测出碳青霉烯酶；不确定结果表示无法判断是否存在碳青霉烯酶。

1.4 酶抑制剂增强试验 将mCIM试验阳性菌株, 配置成0.5麦氏单位菌悬液涂布于MH平板，贴上亚胺培南纸片4张，分别编号为A、B、C、D。抑菌圈A为只贴亚胺培南纸片；抑菌圈B为贴亚胺培南纸片后滴加乙二胺四乙酸(EDTA)10 μl；抑菌圈C为贴亚胺培南纸片后滴加3-氨基苯硼酸(APB)10 μl；抑菌圈D为贴亚胺培南纸片后同时滴加EDTA和APB各10 μl；35 ℃孵育18～24 h后判读结果。当抑菌圈B和抑菌圈A差值≥5 mm时判断该菌产B类金属β-内酰胺酶；当抑菌C和抑菌圈A差值≥5 mm时判断该菌产A类丝氨酸酶碳青霉烯酶；当抑菌圈B或C无明显扩大，但抑菌圈D与抑菌圈A差值≥5 mm时判断该菌同时产A类丝氨酸酶碳青霉烯酶和B类金属β-内酰胺酶[1]。

1.5 GeneXpert检测耐药基因 将待检菌35 ℃血平板孵育16～24 h后，挑取菌落配置成0.5麦氏单位菌悬液。吸取10 μl加至样本处理液，漩涡震荡10 S后吸取1.7 ml混合液加入试剂盒内。用含有Xpert Carba-R的试剂盒将菌株在Cepheid GeneXpertⅩⅤⅠR2系统上进行分析。

2 结 果

2.1 菌株信息 32株CRKP来自于全院13个病区。分别是重症病区(10例)、肝胆病区(3例)、泌尿病区(3例)、呼吸病区(3例)、脑外病区(3例)、普外病区(2例)、烧伤病区(2例)、感染病区(2例)、神内病区(1例)、外四病区(1例)、消化病区(1例)、妇科病区(1例)。

2.2 病原菌药敏结果 32株CRKP对常用抗菌药物氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松、头孢西丁、厄他培南、呋喃妥因耐药率100%；对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美洛培南、环丙沙星、左旋氧氟沙星耐药率>90%；对庆大霉素、妥布霉素耐药率为84.4%；对阿米卡星耐药率为75%；对复方新诺明耐药率为46.9%；对替加环素无耐药株(表1)。

2.3 mCIM试验 mCIM试验结果阳性30株，阴性2株，阳性率为93.8%。

2.4 酶抑制剂增强试验 将30株mCIM试验结果阳性的菌株做酶抑制剂增强试验。结果：1株肺炎克雷伯菌产A类丝氨酸酶加B类金属β-内酰胺酶(图1)，其余29株产A类丝氨酸酶(图2)。

2.5 GeneXpert检测耐药基因 将30株mCIM试验结果阳性的菌株进行KPC、IMP、VIM、NDM-1、OX-48,5种基因检测。结果：1株肺炎克雷伯菌产KPC+NDM(图3)，其余29株均产KPC(图4)，没有产IMP,VIM,OX-48的菌株。

图3 武警四川总队医院肺炎之雷伯菌Gene Xpert检测结果(KPC+NDM)

图4 武警四川总队医院肺炎之雷伯菌Gene Xpert检测结果(KPC)

3 讨 论

肺炎克雷伯菌是临床常见条件致病菌之一。近年来，中国细菌耐药监测(CHINET)显示，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药率逐年增高。我院耐药监测数据显示本院CRKP自2017年来也是处于较高水平。此次研究的32株CRKP,对碳青霉烯类、头孢类、头霉素类、单环类、喹诺酮类、氨基糖苷类等抗菌药物均表现出较高耐药性，仅复方新诺明耐药率46.9%、替加环素耐药率为0。临床单药治疗CRKP较为困难，且本院耐药监测数据2019年第4季度显示部分CRKP菌株对替加环素MIC值有升高现象：之前数据一直为最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)<2，现已出现MIC=2的菌株。有研究提示，对CRKP多种抗生素联合用药不但可以提高药物抗菌效果，而且也可以降低用药剂量[2]。所以对于CRKP治疗推荐临床采用多种抗生素联合用药。同时实验室应积极与临床沟通，开展可能敏感的抗菌药物如多黏菌素、磷霉素、头孢他啶/阿维巴坦的药敏试验和联合药敏试验。

此次研究菌株来自本院13个科室。科室分布广，分离自重症监护病区比例较高。研究提示我院CRKP以产KPC型碳青霉烯酶为主。这与国内流行情况基本一致[3-5]。KPC型碳青霉烯酶基因位于可移动质粒上[6]。携带KPC酶的耐药质粒可在不同菌株间传播，极易发生院内爆发流行。应提醒相关科室及医院感染管控部门高度重视，防止局部暴发流行。

用Ambler分子分类法根据氨基酸序列的相似性把β-内酰胺酶分为4类(A、B、C、D)，其中A、B、D类中存在能水解碳青霉烯类的酶，因此被称为碳青霉烯酶[7-8]。肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶主要是A类酶(KPC、IMI、SME、GES、NMC、SHV),B类酶(NDM、IMP、VIM、GIM、SPM)，D类酶(OXA-48)[9]。其中A,D为丝氨酸酶，B为金属酶。康蓓佩等报道提示CLSI推荐的mCIM试验联合EDTA改良碳青霉烯灭活试验(eCIM)，对于同时产丝氨酸酶和金属酶的菌株，mCIM阳性eCIM阴性，结果与仅产丝氨酸酶菌株相同[5]。王永红等[10]报道，随着共同表达A类和B类碳青霉烯酶菌株分离率的增加，eCIM筛选金属酶的灵敏度会降低，而错误指导碳青霉烯酶抑制剂药物种类的选择。本研究30株mCIM阳性株中，酶抑制剂增强试验结果1株肺炎克雷伯菌产A类丝氨酸酶加B类β-内酰胺酶，其余29株产A类丝氨酸酶。GeneXpert法检测耐药基因结果1株肺炎克雷伯菌产KPC+NDM，其余29株均产KPC，酶型检测和基因检测完全符合。所以对于没有条件进行耐药基因检测的基层单位，mCIM试验协同酶抑制剂增强试验检测CRKP酶型能够满足临床需要。

本研究32株CRKP中,有2株mCIM试验阴性，表示未检测出碳青霉烯酶。本次没有对其进行进一步研究。可能与细菌外膜蛋白缺失或表达下调，合并产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)、头孢菌素酶(AMPC)等耐药机制有关。

综上所述，我院CRKP对常用抗菌药物耐药率较高，耐药机制主要为产碳青霉烯酶，且以产KPC型为主。实验室开展对CRE耐药酶型检测可有效指导临床治疗并为院感防控提供依据。