大蒜素对脑出血大鼠脑组织保护作用的研究

赵军苍

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

脑出血发病率占脑卒中的15%左右，30 d内病死率约为50%，致残率达90%，是严重威胁人类生命健康的疾病之一[1]。病理生理学研究发现，脑出血发生后血液渗漏到外周脑组织，继而出现血脑屏障通透性升高、炎症活性氧自由基(ROS)蓄积、炎症反应等引发脑水肿，是导致继发性脑组织损伤、影响脑出血患者预后的重要因素[2-3]。大蒜素是一种天然存在的具有抗炎、抗氧化等多种生物学活性的二烯丙基三硫化物[4]，既往研究发现其能够通过抑制细胞凋亡、氧化应激和炎症反应而对缺血性脑卒中后脑组织损伤起到保护作用[5-6]。但大蒜素对脑出血后脑组织损伤影响的文献报道尚不多见，本实验通过制备脑出血大鼠模型，探讨了大蒜素对脑出血大鼠脑组织的保护作用及其可能作用机制，现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 无病原微生物级成年雄性SD大鼠240只，体质量(250±20)g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2018-004。清洁环境下适应性饲养1周[光照∶黑暗12 h∶12 h，温度(25±1)℃]后开展实验。

1.2药物与试剂 大蒜素注射液(黑龙江迪龙制药有限公司，规格：2 mL∶30 mg，批号：1903016)；尼莫地平注射液(山东新华制药股份有限公司，规格：10 mL∶2mg，批号：20190427)；伊文思蓝(国药集团化学试剂有限公司，批号：W20181124)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号：20190324，20190130，20190407)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：181125，190317，190112)；兔抗鼠核因子-κB(NF-κB)、β-actin单克隆抗体(武汉博士得生物工程有限公司，批号：20190413，20190328)。

1.3分组、模型制备与干预 将所有大鼠进行数字编码，然后按照随机数字表法随机分为假手术组、脑出血组、大蒜素5 mg/(kg·d)组、大蒜素10 mg/(kg·d)组、大蒜素20 mg/(kg·d)组、尼莫地平2 mg/(kg·d)组，每组40只。参照文献[7]方法制备脑出血大鼠模型：术前12 h禁食禁水，实施麻醉后，分离右侧股动脉并抽取60 μL血液备用；然后取俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪(BN-51700型，美国Stoelting公司)，沿头皮正中切开头部皮肤，剥离骨膜并暴露前囟，于前囱前0.2 mm、中线右旁3.5 mm处钻孔，然后通过微量注射器于深6 mm处(脑基底节区)注射50 μL股动脉血，注射速度为10 μL/min，注射完成15 min后拔针，无菌骨蜡封闭钻孔后缝合皮肤；假手术组大鼠钻孔后于深6 mm处注射50 μL 0.9%氯化钠溶液，其余操作同脑出血组。造模完成后，大蒜素各组给予相应浓度大蒜素注射液2 mL/kg腹腔注射，尼莫地平2 mg/(kg·d)组给予尼莫地平溶液2 mL/kg腹腔注射，假手术组和脑出血组给予0.9%氯化钠溶液2 mL/kg腹腔注射，均1次/d，连续7 d。

1.4观察指标

1.4.1神经功能缺损情况 各组随机取10只大鼠，采用改良神经功能缺损评分标准(mNSS)，由2名经过相关培训的实验人员独立进行评分，得分越高表示神经功能缺损越严重。

1.4.2血脑屏障通透性 参照文献[8]方法，采用伊文思蓝渗透法测定。各组取mNSS评分完成后的10只大鼠，经尾静脉注入浓度2%的伊文思蓝溶液(4 mL/kg)，1 h后实施麻醉，经左心室-右心耳通路快速灌注300 mL 0.9%氯化钠溶液至流出液澄清，断头取脑，称量右半脑质量后研磨匀浆(JJ-2型组织捣碎匀浆机，常州金坛环宇科学仪器厂)，加入3倍量浓度50%的甲酰胺溶液，恒温60 ℃孵育24 h后离心(TDL-5A型离心机，常州亿能实验仪器厂，设置转速3 000 r/min，时间10 min)取上清液，然后通过酶标仪(MR-96A型，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定610 nm波长处吸光度值(OD值)，然后根据标准曲线测定伊文思蓝含量，可反映血脑屏障通透性。

1.4.3脑组织含水量 各组随机取10只大鼠，实施麻醉后迅速断头取脑，切取右侧大脑组织称质量(W1)，置恒温110 ℃烘烤箱24 h至恒重后称质量(W2)，脑组织含水量(%)=(W1-W2)/W1×100%。

1.4.4脑组织病理学表现 各组随机取10只大鼠，麻醉后开胸、暴露心脏，经左心室-右心耳通路快速灌注300 mL 0.9%氯化钠溶液至流出液澄清，灌注4%多聚甲醛溶液实施组织固定，断头取脑，置4%多聚甲醛溶液继续固定72 h，然后依次行石蜡包埋、切片(CUT 4050型，德国Leica公司)、梯度乙醇脱蜡后行HE染色，封片后通过倒置光学显微镜(IX71型，日本Olympus公司)观察脑组织病理学改变。

1.4.5脑组织细胞凋亡情况 取1.4.4中制备的脑组织切片，经梯度乙醇行脱蜡处理后，按照TUNEL试剂盒操作说明依步处理，然后通过倒置光学显微镜(IX71型，日本Olympus公司)观察，细胞核黄褐色为阳性着色。凋亡指数计算：各组大鼠随机取5张切片，每张切片随机取8个互不重叠的视野，计数每个视野内的阳性细胞数和细胞总数，取平均值，凋亡指数=(阳性细胞数/细胞总数)×100%。

1.4.6脑组织中氧化应激指标和炎症细胞因子含量 取各组剩余10只大鼠，麻醉后迅速断头取脑，切取右侧大脑组织，加入9倍量冷裂解液研磨匀浆(JJ-2型组织捣碎匀浆机，常州金坛环宇科学仪器厂)，离心(Allegra 21R型低温离心机，美国Beckman公司，转速3 000 r/min，时间10 min)取上清液，然后黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，高锰酸钾滴定法测定CAT活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，通过酶标仪(MR-96A型，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)按照各ELISA试剂盒操作说明测定炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.4.7脑组织中NF-κB蛋白表达水平 采用Western blot法测定。取1.4.6中制备的脑组织匀浆液，4 ℃低温离心(Allegra 21R型低温离心机，美国Beckman公司，转速12 000 r/min，时间15 min)取上清，按照总蛋白提取试剂盒操作提取蛋白并按照BCA蛋白浓度测定试剂盒操作测定总蛋白含量，然后依次行凝胶电泳(DYCZ-24DN型电泳仪，北京六一生物科技有限公司)、转PVDF膜(DYCZ-40D型转膜仪，北京六一生物科技有限公司)，经5%脱脂奶粉恒37 ℃封闭1 h后，滴加兔抗鼠NF-κB、β-actin单抗后4 ℃孵育12 h，PBS溶液洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗，37 ℃振荡孵育1 h，PBS洗膜后滴加ECL显色发光获得条带；然后以β-actin为内参，以条带灰度值半定量目标蛋白表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠神经功能缺损程度、血脑屏障通透性、脑含水量比较 脑出血组大鼠mNSS评分、脑组织伊文思蓝含量、脑组织含水量均显著高于假手术组(P均<0.05)；大蒜素5 mg/(kg·d)组mNSS评分显著低于脑出血组(P<0.05)，脑组织伊文思蓝含量、脑组织含水量与脑出血组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；大蒜素10 mg/(kg·d)组、大蒜素20 mg/(kg·d)组和尼莫地平2 mg/(kg·d)组mNSS评分、脑组织伊文思蓝含量、脑组织含水量均显著低于脑出血组(P均<0.05)，且大蒜素20 mg/(kg·d)组mNSS评分、脑组织伊文思蓝含量均显著低于尼莫地平2 mg/(kg·d)组(P均<0.05)，脑组织含水量与尼莫地平2 mg/(kg·d)组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各组大鼠脑组织病理学表现 假手术组大鼠脑组织形态、结构正常，神经细胞排列规则有序；脑出血组脑组织明显水肿，神经细胞数量减少、间隙增大，排列无序，胞体皱缩，胞核固缩；大蒜素各组和尼莫地平2 mg/(kg·d)组脑组织病理学改变较脑出血组明显减轻，以大蒜素20 mg/(kg·d)组减轻最为显著。见图1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分、血脑屏障通透性和脑组织含水量比较

图1 各组大鼠脑组织病理学HE染色表现(×200)

2.3各组大鼠脑组织细胞凋亡情况比较 镜下观察，假手术组大鼠脑组织仅可见极少量凋亡细胞，脑出血组血肿周围脑组织凋亡细胞数量明显增多，大蒜素各组和尼莫地平2 mg/(kg·d)组凋亡细胞数量明显减少，以大蒜素20 mg/(kg·d)组减少最为显著，见图2。假手术组、脑出血组、大蒜素5 mg/(kg·d)组、大蒜素10 mg/(kg·d)组、大蒜素20 mg/(kg·d)组、尼莫地平2 mg/(kg·d)组细胞凋亡指数分别为(3.41±0.63)%、(47.25±6.09)%、(41.67±5.34)%、(32.81±4.76)%、(22.63±4.08)%、(27.59±4.22)%，脑出血组显著高于假手术组(P<0.05)，大蒜素各组和尼莫地平2 mg/(kg·d)组均显著低于脑出血组(P均<0.05)，且大蒜素20 mg/(kg·d)组显著低于尼莫地平2 mg/(kg·d)组(P<0.05)。

2.4各组大鼠脑组织中SOD、CAT活性和MDA含量比较 脑出血组SOD、CAT活性显著低于假手术组(P均<0.05),MDA含量显著高于假手术组(P均<0.05)；大蒜素10 mg/(kg·d)组、大蒜素20 mg/(kg·d)组和尼莫地平2 mg/(kg·d)组SOD、CAT活性显著高于脑出血组(P均<0.05),MDA含量显著低于脑出血组(P均<0.05)；且大蒜素20 mg/(kg·d)组SOD活性显著高于尼莫地平2 mg/(kg·d)组(P<0.05),MDA含量显著低于尼莫地平2 mg/(kg·d)组(P<0.05)，2组间CAT活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图2 各组大鼠脑组织细胞凋亡情况(TUNEL，×200)

表2 各组大鼠脑组织中SOD、CAT活性和MDA含量比较

2.5各组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较 脑出血组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著高于假手术组(P均<0.05)；大蒜素10 mg/(kg·d)组、大蒜素20 mg/(kg·d)组和尼莫地平2 mg/(kg·d)组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著低于脑出血组(P均<0.05)；大蒜素20 mg/(kg·d)组TNF-α含量显著低于尼莫地平2 mg/(kg·d)组(P<0.05)，2组间IL-1β、IL-6含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

2.6各组大鼠脑组织中NF-κB蛋白表达水平比较 假手术组、脑出血组、大蒜素5 mg/(kg·d)组、大蒜素10 mg/(kg·d)组、大蒜素20 mg/(kg·d)组、尼莫地平2 mg/(kg·d)组NF-κB蛋白表达水平分别为0.21±0.04，1.15±0.13，1.04±0.12，0.92±0.10，0.36±0.07，0.45±0.08。脑出血组NF-κB蛋白表达水平显著高于假手术组(P<0.05)，大蒜素10mg/(kg·d)组、大蒜素20mg/(kg·d)组、尼莫地平2mg/(kg·d)组均显著低于脑出血组(P均<0.05)，且大蒜素20 mg/(kg·d)组显著低于尼莫地平2mg/(kg·d)组(P<0.05)。

表3 各组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较

见图3。

A为假手术组；B为脑出血组；C为大蒜素5 mg/(kg·d)组；D为大蒜素10 mg/(kg·d)组；E为大蒜素20 mg/(kg·d)组；F为尼莫地平2 mg/(kg·d)组图3 各组大鼠脑组织NF-κB蛋白表达情况

3 讨 论

脑出血发生后，脑组织血氧供应不足导致ROS大量生成、炎症细胞因子释放而引发氧化应激反应和炎症反应，细胞凋亡，破坏血脑屏障并继发脑组织水肿[9-12]，在多种病理通路作用下致使脑组织细胞不可逆性损伤，最终导致神经功能缺损、致残甚至致死。所以，减轻出血早期脑组织损伤对于降低病死率、改善预后具有重要意义。

百合科葱属植物大蒜不仅可做日常食材，其鳞茎可入药，性温、味辛甘，具有消肿止痛、解毒杀虫之功效。现代药理学研究发现，大蒜素是大蒜的主要有效成分，具有良好的抗炎抗氧化[4]、抑制缺血组织细胞凋亡[13]等生物活性。本实验通过自体血注射法制备脑出血大鼠模型并造模成功后立即腹腔注射大蒜素进行干预，研究发现干预7 d后脑出血大鼠mNSS评分明显降低，脑组织形态结构病变减轻，提示大蒜素对脑出血大鼠神经功能和脑组织结构均具有保护作用。

生理状态下伊文思蓝在血管内与蛋白结合，只有血脑屏障结构受损通透性升高后伊文思蓝才能够通过血脑屏障而进入脑组织，所以脑组织内伊文思蓝含量能够反映血脑屏障通透性状态。血脑屏障通透性升高是血管源性脑水肿的主要原因，而脑组织水肿是脑出血后致残、致死的重要病理基础。本研究发现，脑出血大鼠血脑屏障通透性和脑组织含水量明显升高，与顾云鹤等[14]研究报道一致；经大蒜素干预7 d后，脑出血大鼠脑组织伊文思蓝含量、脑组织含水量均明显降低，提示大蒜素具有降低脑出血大鼠血脑屏障通透性、抑制脑组织水肿的作用。

氧化应激和炎症反应在脑出血病理进展过程中发挥着重要作用。脑出血后，脑供血供氧不足导致线粒体呼吸链受阻而生成大量的ROS，以ROS为底物的抗氧化还原酶SOD、CAT过度消耗，导致ROS代谢失衡而过剩，ROS攻击脂质、核酸、蛋白质等大分子，其终产物为MDA；此外，ROS可攻击细胞膜而破坏细胞骨架，破坏构成血脑屏障的基础结构紧密连接蛋白复合体(TJPs)，从而破坏血脑屏障完整性[15]；ROS还能够激活NF-κB而使凋亡相关基因转录表达，促进细胞凋亡，细胞凋亡能够导致组织损伤进一步加重，抑制细胞凋亡能够挽救濒死细胞而减轻脑出血损伤[16]。另外炎症反应贯穿于脑出血损伤的各个阶段，脑出血后病理性刺激炎症细胞因子大量释放，其中TNF-α、IL-1β是触发机体炎症级联反应的主要介质[17]，二者作为趋化因子能够进一步促进自身及IL-6表达上调[18]；此外，TNF-α、IL-1β、IL-6能够直接破坏TJPs结构，激活NF-κB而导致内皮细胞黏附分子表达上调，与内皮细胞黏附而增加血脑屏障通透性[19]。本研究发现，经大蒜素干预7 d后，脑出血大鼠脑组织SOD、CAT活性明显升高，MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及NF-κB蛋白表达水平明显降低，提示大蒜素具有抑制脑出血大鼠氧化应激和炎症反应的作用，并间接说明大蒜素具有保护脑出血大鼠血脑屏障的作用。

综上所述，大蒜素对脑出血大鼠脑组织损伤具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激和炎症反应、下调NF-κB蛋白表达、抑制细胞凋亡、降低血脑屏障通透性有关。

利益冲突：作者声明不存在利益冲突。